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森西赛智科技有限公司
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技术资料/正文
PRIMO 助力气道平滑肌的作用力通路研究
652 人阅读发布时间：2020-03-26 11:35
（ 一） 前言
哮喘、 克罗恩病和高血压是分别影响气管、 肠道和血管的慢性疾病， 都和管状器官的过度收缩有关。 为使气道或血管收缩， 平滑肌细胞（ smooth muscle cells， SM cells） 之间会通过互相联系， 产生连接通路进行力的传递， 引起器官的收缩反应。 目前， 我们对此连接
通路的机制知之甚少。
2018 年， 美国东北大学和哈佛医学院的学者们利用法国 Alveole 公司的 PRIOM“ 定制化细胞微环境制备系统” 创建了 2 个平滑肌细胞的互相作用模型， 对细胞-细胞连接通路和细胞-细胞外基质（ ECM） 连接通路进行了研究， 取得了一系列的成果【 1】 ：
结论 1： ECM 的刚度是一个开关， 当它达到某一个值的时候， 平滑肌力通过 ECM 传导，在这个值以下的时候， 通过细胞-细胞间连接传导。
结论 2： 随着 ECM 刚度的增加， 粘附连接（ adherens junctions)和黏着斑连接（ focaladhesions） 的荧光图像显示， 细胞-细胞间界限逐渐消失， 粘附连接减少， 而黏着斑连接出现。
结论 3： 在相同的 ECM 刚度下， ECM 传导的收缩力也大于细胞-细胞间连接传导的收缩力。这些成果有助于对哮喘和高血压等疾病的进一步研究。
（ 二） 实验设计
2.1 为什么要用 Alveole PRIMO？
要研究 ECM 刚度和 SM 细胞间力的传递的关系， 就要创建一个 SM 细胞模型， 具有可调节刚度的基质， 并能度量细胞-细胞之间， 和细胞-ECM 之间的作用力。 传统方法设计的细胞模型缺点很多： 如分辨率不够、 设计不灵活、 很难对材质进行功能化改造、 耗时长、 人工操作繁琐， 等。 因此， 科学家选择了创新型的全自动的 Alveole PRIMO“ 定制化细胞微环境制备系统” 来创建这个细胞作用力模型； 并通过改变 ECM 刚度， 检测“ 细胞收缩力” ； 确定“ 粘附连接” 和“ 黏着斑连接” 之间转换的 ECM 刚度数值。
2.2 用 PRIMO 进行细胞模型设计
科学家用 PRIMO 在二甲基硅氧烷（ PDMS） 基质上设计了一个长方形的明胶块， 再在上面种植了 2 个相邻的气道平滑肌（ ASM） 细胞形成作用力模型。科学家精心挑选了 NuSil 作为 PDMS， 关键是因为这种透明无孔的材料的刚度可以在E=300Pa-40kPa 间调整。 NuSil 刚度 E=300Pa 时可以模拟健康人气管的 ECM， 而 E=13kPa 和E=40kPa 时用来模拟改造后的 ECM。 改变 NuSil 刚度， 就可以模拟不同刚度的 ECM， 从而判断 ECM 刚度和收缩力传导通路间的关系。实验方法采取的是： 基质的表面功能化（ Micropatterning） ， 步骤如图 1 所示：
图 1. 用 PRIMO 进行 Micropatterning 的实验过程：
图 A、 图 B： 将 NuSil 旋转涂布在玻璃盖玻片上， 在其表面创造出一层均匀的 NuSil 凝胶层。
图 C： NuSil 材料在 60℃下烘烤过夜， 重复以上步骤在 NuSil 上加上一层薄的均匀的荧光微珠层。
图 D、 图 E： 接上聚-L-赖氨酸（PLL） 和 mPEG-SVA， 后者在 PLL 上形成酰胺基团， 阻止细胞粘附在 PLL 上。
图 F： 加入光引发剂 PLPP， 用 PRIMO 投射 UV 光（λ =375nm） 到 NuSil 凝胶的表面， 快速降解暴露在 UV 光下的 PLL-PEG 覆盖层， 产生一个 15µm× 150µm 的长方形微图案。
图 G： 将其与 0.1%明胶（加上 ECM 蛋白） 孵育 1h， 用 PBS 洗涤后， 明胶仅仅保留在长方形
微图案区域。
图 H： 生成的长方形的带荧光的明胶图案。最后， 涂布 ECM 蛋白的 NuSil 凝胶在紫外灭菌后种上“原代人气管平滑肌细胞” （HASMCs） ，
细胞仅粘附在微图案上， 形成互相接触的 2 个细胞的作用力模型。
2.3 实验控制变量及设计
“基质刚度” 调节： NuSil 凝胶由 A 部分和 B 部分原料混合得到， B 部分（交联剂） 的占比可调节最终的基质的刚度（在 Young’ s modulus E=300Pa-40kPa 范围内） 。“细胞收缩力” 检测： NuSil 表面涂布的荧光微珠的直径是 1µm， 通过显微镜观察荧光
微珠的运动， 用傅里叶牵引力显微术（Fourier Traction Force Microscopy） 和 MATLAB软件程序计算得到细胞收缩力大小。
“粘附连接” 和“黏着斑连接” 的观察： β -连环蛋白（β -catenin） 是细胞-细胞间粘附连接（adherens junctions)的标志物， 可染成红色； 而黏着斑蛋白（vinculin） 是细胞-ECM 间黏着斑连接（focal adhesions） 的标志物， 可染成绿色。 细胞用 4%甲醛固定后，同时针对β -连环蛋白和黏着斑蛋白进行染色， 用荧光成像观察这两种标志物蛋白， 从而判断细胞间连接的类型（图 2） 。在相同基质刚度下， “细胞-细胞间有无连接” 会影响“收缩时刻” ： “有连接的细胞对” 用图 1 方法创建， “相邻又无连接的细胞组合” ： 建立新的细胞模型： 在微图案上只种上一颗单独的细胞， 再把这两个微图案同方向连接在一起， 细胞间相邻却无相互作用。 将“细胞对” 和“细胞组合” 的收缩时刻（contractile moment）（可理解为收缩力度， contractilestrength） 进行对比。
（三） 实验结果及讨论
3.1 “ 粘附连接” 和“ 黏着斑连接” 的观察
在细胞水平， 平滑肌（ SM） 细胞可通过钙粘蛋白（ cadherin） 介导的粘附连接和临近的细胞直接联系； 它们也可以通过整联蛋白（ integrin） 介导的黏着斑连接和 ECM 作用， 通过ECM 和远距离的其他 SM 细胞进行间接的联系。
图 2-1.“ 粘附连接” 和“ 黏着斑连接” 的观察：
图 A： 刚度为 E=300Pa 的 NuSil 基质可用来模拟健康的人气管的细胞外基质（ ECM） ， 此时ASM 细胞交界处清楚地显示红色的β -连环蛋白（ 细胞-细胞间粘附连接（ adherens junction)的标志物， 红色） ， 说明形成稳定的细胞-细胞连接。
图 B： 模拟重新建模的刚性更强的 ECM， E =13kPa-40kPa， 当 ECM 刚性增强到 13kPa 时， 可以看出细胞交界处出现了绿色的黏着斑蛋白（ 细胞-ECM 间黏着斑连接(focal adhesion)的标志物， 绿色， 黄色箭头） ， 说明出现细胞-ECM 连接。
图 C： 当 ECM 刚性增强到 40kPa 时， 细胞交界处的β -连环蛋白（ 红色） 完全让位给了黏着斑蛋白（ 绿色， 黄色箭头） ， 说明平滑肌力从“ 细胞-细胞之间传导” 变成了“ 通过 ECM 传导” 。 两个细胞完全分开。
图 2-2. 图 D： Y 轴是被黏着斑连接（ 绿色） 占据的面积， 随基质刚度增加而增加， 说明“ 通过 ECM 传导” 的通路连接增加。
图 E： Y 轴是被粘附连接（ 红色） 占据的面积， 随基质刚度增加而减少， 说明“ 通过细胞-细胞之间传导” 的通路连接减少。科学家发现， 粘附连接区域的减少总是伴随着黏着斑连接区域的增加。
3.2 “细胞-细胞间有无连接” 影响“收缩时刻”
收缩时刻表示的是收缩力度， “有连接的细胞对” 间存在粘附连接， 而“相邻又无连接的细胞组合” 间只存在与 ECM 的黏着斑连接。 实验结果表明： 即使在相同的基质刚度下， 细胞-ECM 间黏着斑连接的收缩力度也要高于细胞-细胞间粘附连接的收缩力度； 细胞-细胞间连接极大地减少了 SM 细胞的整体的收缩力（图略） 。 随着基质刚度增加， 粘附连接减弱，每个 ASM 细胞与 ECM 的作用增强， 收缩时刻（收缩力度） 也明显增加。
3.3 其他实验结果
其他实验结果包括： 随着基质刚度的增加， ASM 细胞对的收缩时刻（收缩力度） 增加；ASM 细胞对连接部位的牵引力增加； 细胞-细胞间作用力强度（Ψ） 减弱（图略） 。
3.4 实验展望
目前的实验结果是细胞种类依赖性的， 如心肌细胞就有不同的结论（细胞-细胞间作用随基质刚性增加而增加） 。 本文只研究了 2 个平滑肌细胞在收缩刺激下的反应， 后续科学家还会进一步研究其在同时有收缩刺激和舒张刺激下的反应， 和多个平滑肌细胞的相互作用，更好地模拟体内生理环境。
（四） 关于 Alveole PRIMO
4.1 PRIMO 的运行原理
图 3. 左图： 选择电脑中任意一张图案， 在 LEONARDO 软件作用下， 用 PRIMO 进行非接触式、无掩模 UV 投射和蚀刻。 PRIMO 模块和大多数倒置显微镜兼容。 右图： PRIMO 通过控制 DMD（Digital Micromirror Device） ， 即 DLP chip 的微型镜片的开合状态， 控制投射在细胞基质上的紫外激光的照射强度、 照射时间和照射区域， 按照图案进行灵活蚀刻【2】 。PRIMO 的 Micropatterning 的实验原理可参考： 生物建模的黑科技——快捷精准的“定制化细胞微环境制备系统” （上） 。
4.2 PRIMO 的主要特点和优势【2】 ：
无掩模： 非接触式、 无掩模 UV 投射成像（波长λ =375nm） ， 可灵活控制 UV 的强度、 照射时间、 区域；
自动化： 全自动快速定制， 可针对实验条件进行快速优化；
高灵活性： 可按照任意图案去构建您的基质和/或使其功能化， 不限图案的大小和复杂程度， 生成不同的细胞模型；
多样性/兼容性： 适用于常规的细胞培养基质， 基质可为平面或有微结构， 可硬可软，如： 玻璃盖玻片、 塑料培养皿、 聚二甲基硅氧烷（PDMS） 、 聚苯乙烯、 水凝胶（PEG 烯酸酯、 聚丙烯酰胺凝胶、 琼脂、 基质胶） 、 光刻胶， 等；
常 用 蛋 白 ： 我 们 的 客 户 日 常 使 用 超 过 10 种 的 各 类 蛋 白 ： Fibrinogen-488,Fibrinogen-647, Fibronectin, GFP, Neutravidin-488, Neutravidin-647,PLL-PEG-Biotin, Protein A-647, Streptavidin, 初级和次级抗体， 等；
高分辨率： 全视野分辨率为 1.2µm（500× 300µm ， 20 倍物镜） ；
多层次： 可蚀刻 256 个灰阶层次， 粘附不同密度层次的蛋白；
多种蛋白： 可应用 3 种不同蛋白（根据实验需求） ；
自动对齐： 自动进行检测和图案定位， 可自动对齐于微结构或者微图案上；
速度快： 蚀刻 500× 300µm 图案， 20 倍物镜， 仅需 30s。
PRIMO 强大的生物建模能力和对细胞微环境的控制， 可以为多种生物学实验带来全新的、 突破性视角， 可用于研究细胞迁移/趋触性、 细胞黏附、 2D/3D 细胞标准化培养、 细胞球培养、 生物力学、 组织工程、 微流体等多个领域。
（五） 附录
更多资讯， 请联系： 森西科技有限公司， 电话： 010-61666616， 热线: 400-687-6366，邮箱： info@sinsitech.com， 网址： www.senxikeji.com。 扫描以下二维码， 关注微信公众号， 获得更多信息：
参考文献：
【1】 Polio, S. R., et. al., Extracellular matrix stiffness regulates force transmission pathways in multicellular ensembles of human airway smooth muscle cells, bioRxiv preprint first posted online Aug.29, 2018, doi:http://dx.doi.org/10.1101/402842.
【2】 Alveole 的官网： https://www.alveolelab.com/
哮喘、 克罗恩病和高血压是分别影响气管、 肠道和血管的慢性疾病， 都和管状器官的过度收缩有关。 为使气道或血管收缩， 平滑肌细胞（ smooth muscle cells， SM cells） 之间会通过互相联系， 产生连接通路进行力的传递， 引起器官的收缩反应。 目前， 我们对此连接
通路的机制知之甚少。
2018 年， 美国东北大学和哈佛医学院的学者们利用法国 Alveole 公司的 PRIOM“ 定制化细胞微环境制备系统” 创建了 2 个平滑肌细胞的互相作用模型， 对细胞-细胞连接通路和细胞-细胞外基质（ ECM） 连接通路进行了研究， 取得了一系列的成果【 1】 ：
结论 1： ECM 的刚度是一个开关， 当它达到某一个值的时候， 平滑肌力通过 ECM 传导，在这个值以下的时候， 通过细胞-细胞间连接传导。
结论 2： 随着 ECM 刚度的增加， 粘附连接（ adherens junctions)和黏着斑连接（ focaladhesions） 的荧光图像显示， 细胞-细胞间界限逐渐消失， 粘附连接减少， 而黏着斑连接出现。
结论 3： 在相同的 ECM 刚度下， ECM 传导的收缩力也大于细胞-细胞间连接传导的收缩力。这些成果有助于对哮喘和高血压等疾病的进一步研究。
（ 二） 实验设计
2.1 为什么要用 Alveole PRIMO？
要研究 ECM 刚度和 SM 细胞间力的传递的关系， 就要创建一个 SM 细胞模型， 具有可调节刚度的基质， 并能度量细胞-细胞之间， 和细胞-ECM 之间的作用力。 传统方法设计的细胞模型缺点很多： 如分辨率不够、 设计不灵活、 很难对材质进行功能化改造、 耗时长、 人工操作繁琐， 等。 因此， 科学家选择了创新型的全自动的 Alveole PRIMO“ 定制化细胞微环境制备系统” 来创建这个细胞作用力模型； 并通过改变 ECM 刚度， 检测“ 细胞收缩力” ； 确定“ 粘附连接” 和“ 黏着斑连接” 之间转换的 ECM 刚度数值。
2.2 用 PRIMO 进行细胞模型设计
科学家用 PRIMO 在二甲基硅氧烷（ PDMS） 基质上设计了一个长方形的明胶块， 再在上面种植了 2 个相邻的气道平滑肌（ ASM） 细胞形成作用力模型。科学家精心挑选了 NuSil 作为 PDMS， 关键是因为这种透明无孔的材料的刚度可以在E=300Pa-40kPa 间调整。 NuSil 刚度 E=300Pa 时可以模拟健康人气管的 ECM， 而 E=13kPa 和E=40kPa 时用来模拟改造后的 ECM。 改变 NuSil 刚度， 就可以模拟不同刚度的 ECM， 从而判断 ECM 刚度和收缩力传导通路间的关系。实验方法采取的是： 基质的表面功能化（ Micropatterning） ， 步骤如图 1 所示：
图 1. 用 PRIMO 进行 Micropatterning 的实验过程：
图 A、 图 B： 将 NuSil 旋转涂布在玻璃盖玻片上， 在其表面创造出一层均匀的 NuSil 凝胶层。
图 C： NuSil 材料在 60℃下烘烤过夜， 重复以上步骤在 NuSil 上加上一层薄的均匀的荧光微珠层。
图 D、 图 E： 接上聚-L-赖氨酸（PLL） 和 mPEG-SVA， 后者在 PLL 上形成酰胺基团， 阻止细胞粘附在 PLL 上。
图 F： 加入光引发剂 PLPP， 用 PRIMO 投射 UV 光（λ =375nm） 到 NuSil 凝胶的表面， 快速降解暴露在 UV 光下的 PLL-PEG 覆盖层， 产生一个 15µm× 150µm 的长方形微图案。
图 G： 将其与 0.1%明胶（加上 ECM 蛋白） 孵育 1h， 用 PBS 洗涤后， 明胶仅仅保留在长方形
微图案区域。
图 H： 生成的长方形的带荧光的明胶图案。最后， 涂布 ECM 蛋白的 NuSil 凝胶在紫外灭菌后种上“原代人气管平滑肌细胞” （HASMCs） ，
细胞仅粘附在微图案上， 形成互相接触的 2 个细胞的作用力模型。
2.3 实验控制变量及设计
“基质刚度” 调节： NuSil 凝胶由 A 部分和 B 部分原料混合得到， B 部分（交联剂） 的占比可调节最终的基质的刚度（在 Young’ s modulus E=300Pa-40kPa 范围内） 。“细胞收缩力” 检测： NuSil 表面涂布的荧光微珠的直径是 1µm， 通过显微镜观察荧光
微珠的运动， 用傅里叶牵引力显微术（Fourier Traction Force Microscopy） 和 MATLAB软件程序计算得到细胞收缩力大小。
“粘附连接” 和“黏着斑连接” 的观察： β -连环蛋白（β -catenin） 是细胞-细胞间粘附连接（adherens junctions)的标志物， 可染成红色； 而黏着斑蛋白（vinculin） 是细胞-ECM 间黏着斑连接（focal adhesions） 的标志物， 可染成绿色。 细胞用 4%甲醛固定后，同时针对β -连环蛋白和黏着斑蛋白进行染色， 用荧光成像观察这两种标志物蛋白， 从而判断细胞间连接的类型（图 2） 。在相同基质刚度下， “细胞-细胞间有无连接” 会影响“收缩时刻” ： “有连接的细胞对” 用图 1 方法创建， “相邻又无连接的细胞组合” ： 建立新的细胞模型： 在微图案上只种上一颗单独的细胞， 再把这两个微图案同方向连接在一起， 细胞间相邻却无相互作用。 将“细胞对” 和“细胞组合” 的收缩时刻（contractile moment）（可理解为收缩力度， contractilestrength） 进行对比。
（三） 实验结果及讨论
3.1 “ 粘附连接” 和“ 黏着斑连接” 的观察
在细胞水平， 平滑肌（ SM） 细胞可通过钙粘蛋白（ cadherin） 介导的粘附连接和临近的细胞直接联系； 它们也可以通过整联蛋白（ integrin） 介导的黏着斑连接和 ECM 作用， 通过ECM 和远距离的其他 SM 细胞进行间接的联系。
图 2-1.“ 粘附连接” 和“ 黏着斑连接” 的观察：
图 A： 刚度为 E=300Pa 的 NuSil 基质可用来模拟健康的人气管的细胞外基质（ ECM） ， 此时ASM 细胞交界处清楚地显示红色的β -连环蛋白（ 细胞-细胞间粘附连接（ adherens junction)的标志物， 红色） ， 说明形成稳定的细胞-细胞连接。
图 B： 模拟重新建模的刚性更强的 ECM， E =13kPa-40kPa， 当 ECM 刚性增强到 13kPa 时， 可以看出细胞交界处出现了绿色的黏着斑蛋白（ 细胞-ECM 间黏着斑连接(focal adhesion)的标志物， 绿色， 黄色箭头） ， 说明出现细胞-ECM 连接。
图 C： 当 ECM 刚性增强到 40kPa 时， 细胞交界处的β -连环蛋白（ 红色） 完全让位给了黏着斑蛋白（ 绿色， 黄色箭头） ， 说明平滑肌力从“ 细胞-细胞之间传导” 变成了“ 通过 ECM 传导” 。 两个细胞完全分开。
图 2-2. 图 D： Y 轴是被黏着斑连接（ 绿色） 占据的面积， 随基质刚度增加而增加， 说明“ 通过 ECM 传导” 的通路连接增加。
图 E： Y 轴是被粘附连接（ 红色） 占据的面积， 随基质刚度增加而减少， 说明“ 通过细胞-细胞之间传导” 的通路连接减少。科学家发现， 粘附连接区域的减少总是伴随着黏着斑连接区域的增加。
3.2 “细胞-细胞间有无连接” 影响“收缩时刻”
收缩时刻表示的是收缩力度， “有连接的细胞对” 间存在粘附连接， 而“相邻又无连接的细胞组合” 间只存在与 ECM 的黏着斑连接。 实验结果表明： 即使在相同的基质刚度下， 细胞-ECM 间黏着斑连接的收缩力度也要高于细胞-细胞间粘附连接的收缩力度； 细胞-细胞间连接极大地减少了 SM 细胞的整体的收缩力（图略） 。 随着基质刚度增加， 粘附连接减弱，每个 ASM 细胞与 ECM 的作用增强， 收缩时刻（收缩力度） 也明显增加。
3.3 其他实验结果
其他实验结果包括： 随着基质刚度的增加， ASM 细胞对的收缩时刻（收缩力度） 增加；ASM 细胞对连接部位的牵引力增加； 细胞-细胞间作用力强度（Ψ） 减弱（图略） 。
3.4 实验展望
目前的实验结果是细胞种类依赖性的， 如心肌细胞就有不同的结论（细胞-细胞间作用随基质刚性增加而增加） 。 本文只研究了 2 个平滑肌细胞在收缩刺激下的反应， 后续科学家还会进一步研究其在同时有收缩刺激和舒张刺激下的反应， 和多个平滑肌细胞的相互作用，更好地模拟体内生理环境。
（四） 关于 Alveole PRIMO
4.1 PRIMO 的运行原理
图 3. 左图： 选择电脑中任意一张图案， 在 LEONARDO 软件作用下， 用 PRIMO 进行非接触式、无掩模 UV 投射和蚀刻。 PRIMO 模块和大多数倒置显微镜兼容。 右图： PRIMO 通过控制 DMD（Digital Micromirror Device） ， 即 DLP chip 的微型镜片的开合状态， 控制投射在细胞基质上的紫外激光的照射强度、 照射时间和照射区域， 按照图案进行灵活蚀刻【2】 。PRIMO 的 Micropatterning 的实验原理可参考： 生物建模的黑科技——快捷精准的“定制化细胞微环境制备系统” （上） 。
4.2 PRIMO 的主要特点和优势【2】 ：
无掩模： 非接触式、 无掩模 UV 投射成像（波长λ =375nm） ， 可灵活控制 UV 的强度、 照射时间、 区域；
自动化： 全自动快速定制， 可针对实验条件进行快速优化；
高灵活性： 可按照任意图案去构建您的基质和/或使其功能化， 不限图案的大小和复杂程度， 生成不同的细胞模型；
多样性/兼容性： 适用于常规的细胞培养基质， 基质可为平面或有微结构， 可硬可软，如： 玻璃盖玻片、 塑料培养皿、 聚二甲基硅氧烷（PDMS） 、 聚苯乙烯、 水凝胶（PEG 烯酸酯、 聚丙烯酰胺凝胶、 琼脂、 基质胶） 、 光刻胶， 等；
常 用 蛋 白 ： 我 们 的 客 户 日 常 使 用 超 过 10 种 的 各 类 蛋 白 ： Fibrinogen-488,Fibrinogen-647, Fibronectin, GFP, Neutravidin-488, Neutravidin-647,PLL-PEG-Biotin, Protein A-647, Streptavidin, 初级和次级抗体， 等；
高分辨率： 全视野分辨率为 1.2µm（500× 300µm ， 20 倍物镜） ；
多层次： 可蚀刻 256 个灰阶层次， 粘附不同密度层次的蛋白；
多种蛋白： 可应用 3 种不同蛋白（根据实验需求） ；
自动对齐： 自动进行检测和图案定位， 可自动对齐于微结构或者微图案上；
速度快： 蚀刻 500× 300µm 图案， 20 倍物镜， 仅需 30s。
PRIMO 强大的生物建模能力和对细胞微环境的控制， 可以为多种生物学实验带来全新的、 突破性视角， 可用于研究细胞迁移/趋触性、 细胞黏附、 2D/3D 细胞标准化培养、 细胞球培养、 生物力学、 组织工程、 微流体等多个领域。
（五） 附录
更多资讯， 请联系： 森西科技有限公司， 电话： 010-61666616， 热线: 400-687-6366，邮箱： info@sinsitech.com， 网址： www.senxikeji.com。 扫描以下二维码， 关注微信公众号， 获得更多信息：
参考文献：
【1】 Polio, S. R., et. al., Extracellular matrix stiffness regulates force transmission pathways in multicellular ensembles of human airway smooth muscle cells, bioRxiv preprint first posted online Aug.29, 2018, doi:http://dx.doi.org/10.1101/402842.
【2】 Alveole 的官网： https://www.alveolelab.com/