⚫ 您想省时省力，直接从全血中全自动获取 90%捕获率和高纯度的稀有免疫细胞吗？
⚫ 您想研究稀有功能性免疫细胞的 immuno-profiling 吗？
⚫ 您想研究免疫细胞的 PD-1 或其他标志物，为癌症免疫治疗提供信息吗？
⚫ 您想研究输入人体后的 CAR-T 细胞吗？
MiSelect R 帮您实现您的需求！
用流式方法无法检测稀有免疫细胞？富集后还有几百上千颗白细胞？做一次稀有细胞检测，用到好几台仪器，还不能拿到活的细胞？这些方法都过时啦！ MiCareo 公司的MiSelect R 稀有细胞高效获取分析系统是目前唯一一款集稀有细胞（包括“循环肿瘤细胞CTCs”）富集与鉴定于一体的全自动化设备，技术法宝包括微流控技术、激光分选、体积过滤和荧光标记成像，既可以对稀有细胞进行计数、分析和鉴定（生物标志物分析） ，又
可以获得高捕获率、高纯度、高活性的稀有细胞， 供下游研究使用。表面标志物的检测能够分析鉴定稀有功能性免疫细胞，反映免疫系统的动态变化，是研究免疫机制的有效策略，尤其对于癌症免疫治疗能够有很好的指导作用。现有的确定是否进行 PD-1/PD-L1 治疗的检测方法是取肿瘤组织样本，用 IHC（免疫组化）检测组织中的PD-1、 PD-L1 的表达及表达量，及结合基因分析检测 TMB（肿瘤突变负荷）、 MSI（微卫星不稳定）、 dMMR（错配修复缺陷）等指标【1】【2】 。而在实践中，病人的肿瘤组织往往已经被切除了，或它的位置使其很难取得病理切片， 我们就可以考虑从外周血中获取 PD-1/PDL1 信息，如 CTCs 上的 PD-L1 表达信息和 T 细胞的 PD-1 表达信息。肿瘤细胞的刺激使淋巴系统产生大量的功能性免疫细胞，再运送到肿瘤组织周围，所以在外周血中就可以获取该免疫系统信息。 对 CAR-T 治疗患者，我们也可以从外周血中分离 CAR-T 细胞，对输入人体后的该稀有细胞进行研究。

图 1. Miselect R 稀有细胞高效获取分析系统，全自动，省时省力
免疫细胞的生物标志物分析包括：
(1) 检测、分析含量在十万分之一以下的稀有功能性免疫细胞；
(2) 免疫细胞的分型分析；
(3) 检测 T 细胞的 PD-1 的表达及表达量，用于筛选适用于 PD-1/PD-L1 检查点抑制剂的患者。

（一）稀有功能性免疫细胞的检测
1.1 MiSelect R 系统相对于流式细胞仪的优势【3】
流式细胞仪的检测灵敏度不到十万分之一， 1mL 全血中 1000 个数量以下的细胞就很难检测出来了，而且绝大多数流式细胞仪不能提供细胞的影像学信息（图 2）。 MiSelect R 系统可以对细胞进行多重荧光标记及高解析影像分析，从而识别携带特定抗原的免疫细胞（图3）。 MiSelect R 系统不仅可以检测到 CD3(+)CD8(+)T 细胞， CD3(+)PD-1(+)T 细胞， CD8(+)PD-1(+)T 细胞， 并且对罕见细胞亚型灵敏度更加突出（图 4）， 可检测、分析含量在十万分之一以下的稀有功能性免疫细胞。

图 2. 当靶细胞数量低于 1/100,000 时，流式细胞仪不能检测。

图 3. MiSelect R 可检测稀有功能性免疫细胞。

1.2 与流式细胞仪的灵敏度对比【3】【5】
流式细胞仪的前处理需要进行梯度离心取白细胞层进行染色（可能丢失稀有免疫细胞）； MiSelect R 系统直接对全血进行染色标记。

图 4. MiSelect R 系统的灵敏度至少是流式细胞仪的 2 倍。对于某些稀有免疫细胞， MiSelectR 可以检测出来， 而流式细胞仪已经无法检测到了。

1.3 免疫细胞的分型分析【3】
根据免疫细胞表面的生物标志物，免疫细胞可分为>16 类。 MiSelect R 可以对免疫细胞进行分型分析，判断免疫细胞的活性（图 5）。不同的肿瘤具有独特的免疫细胞图谱，也意味着具有独特的肿瘤微环境，肿瘤微环境关系到肿瘤的发生、发展和治疗。研究免疫细胞分型对癌症的免疫治疗及预测预后有着重要的意义。

图 5. MiSelect R 将免疫细胞分为高度活性的、中度活性的和丧失活性的。
最理想的稀有细胞富集、鉴定方法应该具有高捕获率、高纯度、操作简单和结果可重复等特点。 MiSelect R 都能实现，具有比竞争对手更显著的优势。尤其是以大小分离 CTCs 的竞争对手，无法做稀有免疫细胞分析。

（二） MiSelect R 的原理和特点【3】【4】
2.1 激光分选

图 6.全血直接标记上样，不丢失稀有细胞； 通过微流控芯片（SelectChip Dual） 和 eDAR（ensemble-Decision Aliquot Ranking） 技术将含有靶细胞的纳升液滴分流到筛选富集区； 检测到荧光标记，则进行分选（左图）。 上样量 2× 8mL。

2.2 过滤富集

图 7. 5 微米的过滤栅栏筛掉红细胞和小于 5 微米的白细胞， 保证捕获到最小的稀有免疫细胞。

2.3 荧光标记成像分析

图 8. 富集纯化的细胞在芯片上自动完成固定、染色、清洗及成像。 全自动化图像采集，高解析成像软件。 一个细胞可进行 8 色标记（7 色生物荧光标志物+1 色明场）。 可洗涤进行重复染色标记。 对稀有功能性免疫细胞，可通过多重荧光标记，鉴定出靶细胞。

2.4 稀有免疫细胞的收集

图 9. 通过微流控芯片（SelectChip Retrieval） 两步 eDAR 技术，可收集高活性的稀有免疫细胞。不涉及过滤富集和荧光标记成像。 上样量： 1× 8mL。

2.5 准确度、重复性和特异性
MiSelect R 对稀有免疫细胞检测有较高的灵敏度，灵敏度至少是流式细胞仪的 2 倍，系统检测的 CV 值＜10%， 特异性 100%。

（三） MiSelect R 的特点小结
⚫ 快速全血样本上样，无需细胞裂解、密度梯度离心及磁珠筛选， 避免遗漏细胞；
⚫ 全自动化操作平台， 单机集成， 自动富集、纯化、荧光标记、影像分析；
⚫ 重复性高，重复性可达 90%以上， CV 值低于 10%；
⚫ 快速捕获关键生物标志物信息，可在同一细胞上标记 7-14 种生物标志物；
⚫ 超高捕获率>90%， 可高达 98.5%；
⚫ 可获得高纯度稀有细胞（包括 CTCs） （靶细胞纯度>60%， 挑取单细胞后纯度可达到100%）；
⚫ 可检测 EpCAM 低表达的肿瘤细胞株， 如 MDA-MB-231 细胞；
⚫ 高分辨率细胞影像便于判读分析；
⚫ 保留细胞完整性，可进一步提取核酸，获得基因组信息；
⚫ 操作简捷， 20 min 手动操作， 3-4 小时完成两个 8mL 全血样本的分析；
⚫ 适用于 CTCs、稀有免疫细胞、自身反应性 T 细胞、淋巴母细胞、母体血液中的胎儿细胞、癌症干细胞等的计数、分离和鉴定。

（四）总结
和市面上其他稀有细胞检测方法不同， MiSelect R 可对稀有细胞进行计数、分析、鉴定，并获得活细胞。具有高纯度（>60%） 、高捕获率（98.5%） 、高细胞活性（>99%） 、 高检测灵敏度、可重复性（CV<10%） 、可视性、 广谱性以及全自动运行（操作简单，全血上样，全自动运行，单机集成）等优点，可检测 EpCAM 低表达的肿瘤细胞株，灵敏度是流式细胞仪的 2 倍。可用于 CTCs 研究、 癌症药物的伴随诊断、稀有功能性免疫细胞研究，或产前无创检测，是非常强大的稀有细胞高效获取分析系统。
CTCs 应用请看上一篇介绍： 稀有细胞检测的突破——MiSelect R 助力 CTCs 检测。

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参考文献：
【1】 抗 PD-1/PD-L1 免疫治疗时 如何筛选生物标志物，医脉通， 2018-01-17
【2】 一个简单的检测指标，可以提前告诉你是不是使用 PD-1/PD-L1 有效的幸运儿？全球好药资讯， 2017-11-12
【3】 MiSelect R PPT
【4】 MiSelect R website: https://www.micareo.com/
【5】 Excellent Sensitivity for Immune Cell Detection by the MiSelect R System,Application Note