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森西赛智科技有限公司
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技术资料/正文
PRIMO 助力“ 类器官芯片” 研究
2100 人阅读发布时间：2021-05-14 15:30
（ 一） 前言
目前， 微制造（ Microfabrication） 技术可以利用越来越多的材料和工艺在体外创建三维组织， 生成微芯片， 模拟高度复杂的生理病理条件， 为临床提供潜在的解决方案。 然而，微制造是一个复杂的、 多步骤的过程， 制作一个用于特定应用的芯片既费时又费钱， 充满挑战。
（ 二） 类器官芯片举例
韩国科学家 Kim 利用聚二甲基硅氧烷（ PDMS） 在光刻胶 SU-8 上倒模创造出类器官芯片【 1】 （ 图 1） 。 通过改变人脐静脉内皮细胞（ HUVECs） 的培养方法， 形成不同的血管结构。
图 1. 不同的实验设计， HUVECs 细胞在芯片中发展成血管生成（ Vasculogenesis） 或血管新生（ Angiogenesis） 。
（ C-D 图） ： HUVECs 细胞包埋在 3D 纤维蛋白基质中注入中间腔室（ C 部分） ； LFs 细胞（ 正常人肺成纤维细胞） 包埋在纤维蛋白基质中注入双外侧腔室（ LO 和 RO 部分） ， HUVECs细胞发展成血管生成（ Vasculogenesis） 。
（ E-F 图） ： HUVECs 细胞包被在中间腔室的左侧壁， 腔室中是纤维蛋白基质， LFs 细胞包埋在纤维蛋白基质中注入外右侧腔室（ 仅 RO 部分） ， HUVECs 细胞发展成血管新生（ Angiogenesis） 。
（ 图 2） 是对血管生成（ Vasculogenesis） （ 图 A-D)和血管新生（ Angiogenesis） （ 图E-H） 的成像对比。 （ 图 I） 是 A-D 中管状物的面积%对比； （ 图 J） 是 E-H 中平均芽状物长度的对比。 可见随时间进程可形成更多的血管结构。荧光微珠和 FITC-葡聚糖溶液也可以在生成的血管结构中自由流动， 而不渗出（ 图 3） ，说明 HUVECs 细胞生成的血管结构具有功能性。 更多高清图像请看原文。
图 2. 对血管生成（Vasculogenesis） （图 A-D)和血管新生（Angiogenesis） （图 E-H）
的成像对比。
图 3. 血管结构具有功能性， 无渗透。
图 A： 内皮细胞（F-actin 标记， 绿色） 管腔内的聚苯乙烯荧光微珠（7µm， 红色） ， 可以自由移动。
图 B： FITC-葡聚糖溶液（70kDa， 绿色） 注入 HUVECs 血管（红色） ， 可以自由流动。标记的微珠和葡聚糖溶液均没有渗入血管外部的纤维蛋白基质中。
（三） 用 Aveole PRIMO 设计类器官芯片
在 Kim 的实验中， 利用普通光刻法制作芯片。 法国 Alveole 公司的 PRIOM“定制化细胞微环境制备系统” ， 是一种无掩模和非接触式的 UV 投射系统， 可以利用紫外线敏感的光刻胶（photoresists） 快速生成微工程化的细胞微环境模型。 这项技术简单、 快捷、 灵活， 可以用于各类设计的日常创新和优化。 如果 Kim 采用 PRIMO 制作芯片， 将更快更好地得到有功能性的血管结构。
Alveole 的科学家用 PRIMO 设计类器官芯片（organ-on-a-chip） 来模拟造血干细胞的微生态环境（microniche） ， 包括在时空上组织、 模拟它的主要细胞成分， 如成骨细胞、内皮细胞和干细胞【2】 。
3.1 PRIMO 的原理
PRIMO 安装在倒置显微镜上， 根据上传到 LEONARDO 软件的图案， 借助微镜片阵列调节UV 光线投射的强度、 时间和区域， 将图案通过显微镜的物镜投射到样本上（ 图 4） 。 可选择任意的 PDF 或 TIF 图案上传到软件进行投射。
图 4. PRIMO 安装在倒置显微镜上
3.2 实验流程
1） 样本准备
玻璃晶片上旋转涂布光刻胶 SU-8 3050 进行一段时间烘培。
2） 用 UV 光照射光刻胶
将玻璃晶片倒置在显微镜上， 使光刻胶（ SU-8） 层对准 4x 物镜（ 图 5， 步骤 1） 。 通过LEONARNO 软件， 将芯片的设计图像投射到光刻胶层上。 虽然图像超过了物镜视野的大小，还是能被自动切割分别投射， 最后连接在一起， 形成密闭不透水的管路（ 图 5， 步骤 2 和 3）。
3） 照射后烘焙
对光刻胶基质继续进行烘焙和固化（ 图 5， 步骤 4） 。
4） PDMS（ 聚二甲基硅氧烷） 倒模
获得的光刻胶（ SU-8） 模具进行硅烷化后， 将 Sylgard 184 PDMS 和固化剂（ 比例 10:1）倒在光刻胶模具上形成 PDMS 芯片（ 图 5， 步骤 5） 。 烘焙后， 将 PDMS 芯片从光刻胶模具上剥下， 放在玻璃载玻片上（ 图 5， 步骤 6） 。
5） 细胞培养
人脐静脉内皮细胞（ HUVEC） 、 人胎儿成骨细胞（ hFOB） 和造血干细胞（ HSC） 分别重悬在胶原蛋白/纤维蛋白的水凝胶中， 注射到芯片的不同腔室中进行 3D 培养。
图 5. 用 PRIMO 进行 PDMS 芯片微制造的原理示意图
3.3 应用： 芯片优化和 3D 细胞培养
图 6. 芯片设计优化和 PDMS 芯片成品。
（图 6A） 是最初的设计（根据 Kim et al.的文献【1】 ） ， 中间的通道可以注射细胞，两侧的通道既可以注射细胞也可以注射营养物质。
（图 6B 和 3C） 展示了更复杂的芯片设计， 加上了其他通道。
（图 6D） 显示的是 PDMS 芯片的成品， 特殊结构的 PDMS 芯片安装在玻璃载玻片上， 芯片通道的入口处设计了穿孔装置， 用来注射细胞进入不同的腔室。
图 7. 在微制造的芯片中进行 3D 细胞培养。
（图 7A） 显示 PDMS 芯片中在 3D 胶原蛋白/纤维蛋白水凝胶中培养的 HUVEC 细胞， 它们自发地形成了有功能的血管结构。
（图 7B） 显示该结构能够将荧光微珠从一个腔室传递到另一个腔室， 即具有功能性。
（图 7C） 最终， 研究者将不同类型的细胞注射到芯片的不同的腔室/管道里， 以重现造血干细胞的微生态环境： 顶部腔室里的成骨细胞模拟骨骼成分， 底部腔室里的 HUVEC 细胞模拟血管成分， 造血干细胞被注射进入中间的通道。
（四） 实验结论
因为可以基于图像进行无掩模的 UV 投射， PRIMO 是进行微制造快速建模的强有力工具，可以用于日常的灵活的创建新模型。 通过投射得到的 SU8 结构可以被用来作为模具， 创造PDMS 芯片， 各种细胞就可以在分割的腔室中进行 3D 生长。 研究者将 3 种不同的细胞在芯片的不同腔室里培养数日， 展示了这个芯片的极佳的生物相容性。 生成的类器官芯片被用来模拟造血干细胞的微生态环境。
（五） PRIMO 介绍
PRIMO 的芯片微制造（Microfabrication） 的实验原理可参考： 生物建模的黑科技——快捷精准的“定制化细胞微环境制备系统” （下） 。
5.1 PRIMO 的主要特点和优势【3】 ：
无掩模： 非接触式、 无掩模 UV 投射成像（波长λ =375nm） ， 可灵活控制 UV 的强度、 照射时间、 区域；
自动化： 全自动快速定制， 可针对实验条件进行快速优化；
高灵活性： 可按照任意图案去构建您的基质和/或使其功能化， 不限图案的大小和复杂程度， 生成不同的细胞模型；
多样性/兼容性： 适用于常规的细胞培养基质， 基质可为平面或有微结构， 可硬可软，如： 玻璃盖玻片、 塑料培养皿、 聚二甲基硅氧烷（PDMS） 、 聚苯乙烯、 水凝胶（PEG 丙烯酸酯、 聚丙烯酰胺凝胶、 琼脂、 基质胶） 、 光刻胶， 等；
常 用 蛋 白 ： 我 们 的 客 户 日 常 使 用 超 过 10 种 的 各 类 蛋 白 ： Fibrinogen-488,Fibrinogen-647, Fibronectin, GFP, Neutravidin-488, Neutravidin-647,PLL-PEG-Biotin, Protein A-647, Streptavidin, 初级和次级抗体， 等；
高分辨率： 全视野分辨率为 1.2µm（500× 300µm ， 20 倍物镜） ；
多层次： 可蚀刻 256 个灰阶层次， 粘附不同密度层次的蛋白；
多种蛋白： 可应用 3 种不同蛋白（根据实验需求） ；
自动对齐： 自动进行检测和图案定位， 可自动对齐于微结构或者微图案上；
速度快： 蚀刻 500× 300µm 图案， 20 倍物镜， 仅需 30s。
5.2 PRIMO 的应用领域
PRIMO 强大的生物建模能力和对细胞微环境的控制， 可以为多种生物学实验带来全新的、 突破性视角， 可用于研究细胞迁移/趋触性、 细胞黏附、 2D/3D 细胞标准化培养、 细胞球培养、 生物力学、 组织工程、 微流体芯片， 等多个领域。
（六） 附录
更多资讯， 请联系： 森西科技有限公司， 电话： 010-61666616， 热线: 400-687-6366，邮箱： info@sinsitech.com， 网址： www.senxikeji.com。
参考文献：
【1】 Kim et al., Lab Chip, 2013, 13(8):1489-500.
【2】 Souquet B.,et.al.,Fast prototyping of organ-on-a-chip with PRIMO, Alveole Application Note.
【3】 Alveole 的官网： https://www.alveolelab.com/
目前， 微制造（ Microfabrication） 技术可以利用越来越多的材料和工艺在体外创建三维组织， 生成微芯片， 模拟高度复杂的生理病理条件， 为临床提供潜在的解决方案。 然而，微制造是一个复杂的、 多步骤的过程， 制作一个用于特定应用的芯片既费时又费钱， 充满挑战。
（ 二） 类器官芯片举例
韩国科学家 Kim 利用聚二甲基硅氧烷（ PDMS） 在光刻胶 SU-8 上倒模创造出类器官芯片【 1】 （ 图 1） 。 通过改变人脐静脉内皮细胞（ HUVECs） 的培养方法， 形成不同的血管结构。
图 1. 不同的实验设计， HUVECs 细胞在芯片中发展成血管生成（ Vasculogenesis） 或血管新生（ Angiogenesis） 。
（ C-D 图） ： HUVECs 细胞包埋在 3D 纤维蛋白基质中注入中间腔室（ C 部分） ； LFs 细胞（ 正常人肺成纤维细胞） 包埋在纤维蛋白基质中注入双外侧腔室（ LO 和 RO 部分） ， HUVECs细胞发展成血管生成（ Vasculogenesis） 。
（ E-F 图） ： HUVECs 细胞包被在中间腔室的左侧壁， 腔室中是纤维蛋白基质， LFs 细胞包埋在纤维蛋白基质中注入外右侧腔室（ 仅 RO 部分） ， HUVECs 细胞发展成血管新生（ Angiogenesis） 。
（ 图 2） 是对血管生成（ Vasculogenesis） （ 图 A-D)和血管新生（ Angiogenesis） （ 图E-H） 的成像对比。 （ 图 I） 是 A-D 中管状物的面积%对比； （ 图 J） 是 E-H 中平均芽状物长度的对比。 可见随时间进程可形成更多的血管结构。荧光微珠和 FITC-葡聚糖溶液也可以在生成的血管结构中自由流动， 而不渗出（ 图 3） ，说明 HUVECs 细胞生成的血管结构具有功能性。 更多高清图像请看原文。
图 2. 对血管生成（Vasculogenesis） （图 A-D)和血管新生（Angiogenesis） （图 E-H）
的成像对比。
图 3. 血管结构具有功能性， 无渗透。
图 A： 内皮细胞（F-actin 标记， 绿色） 管腔内的聚苯乙烯荧光微珠（7µm， 红色） ， 可以自由移动。
图 B： FITC-葡聚糖溶液（70kDa， 绿色） 注入 HUVECs 血管（红色） ， 可以自由流动。标记的微珠和葡聚糖溶液均没有渗入血管外部的纤维蛋白基质中。
（三） 用 Aveole PRIMO 设计类器官芯片
在 Kim 的实验中， 利用普通光刻法制作芯片。 法国 Alveole 公司的 PRIOM“定制化细胞微环境制备系统” ， 是一种无掩模和非接触式的 UV 投射系统， 可以利用紫外线敏感的光刻胶（photoresists） 快速生成微工程化的细胞微环境模型。 这项技术简单、 快捷、 灵活， 可以用于各类设计的日常创新和优化。 如果 Kim 采用 PRIMO 制作芯片， 将更快更好地得到有功能性的血管结构。
Alveole 的科学家用 PRIMO 设计类器官芯片（organ-on-a-chip） 来模拟造血干细胞的微生态环境（microniche） ， 包括在时空上组织、 模拟它的主要细胞成分， 如成骨细胞、内皮细胞和干细胞【2】 。
3.1 PRIMO 的原理
PRIMO 安装在倒置显微镜上， 根据上传到 LEONARDO 软件的图案， 借助微镜片阵列调节UV 光线投射的强度、 时间和区域， 将图案通过显微镜的物镜投射到样本上（ 图 4） 。 可选择任意的 PDF 或 TIF 图案上传到软件进行投射。
图 4. PRIMO 安装在倒置显微镜上
3.2 实验流程
1） 样本准备
玻璃晶片上旋转涂布光刻胶 SU-8 3050 进行一段时间烘培。
2） 用 UV 光照射光刻胶
将玻璃晶片倒置在显微镜上， 使光刻胶（ SU-8） 层对准 4x 物镜（ 图 5， 步骤 1） 。 通过LEONARNO 软件， 将芯片的设计图像投射到光刻胶层上。 虽然图像超过了物镜视野的大小，还是能被自动切割分别投射， 最后连接在一起， 形成密闭不透水的管路（ 图 5， 步骤 2 和 3）。
3） 照射后烘焙
对光刻胶基质继续进行烘焙和固化（ 图 5， 步骤 4） 。
4） PDMS（ 聚二甲基硅氧烷） 倒模
获得的光刻胶（ SU-8） 模具进行硅烷化后， 将 Sylgard 184 PDMS 和固化剂（ 比例 10:1）倒在光刻胶模具上形成 PDMS 芯片（ 图 5， 步骤 5） 。 烘焙后， 将 PDMS 芯片从光刻胶模具上剥下， 放在玻璃载玻片上（ 图 5， 步骤 6） 。
5） 细胞培养
人脐静脉内皮细胞（ HUVEC） 、 人胎儿成骨细胞（ hFOB） 和造血干细胞（ HSC） 分别重悬在胶原蛋白/纤维蛋白的水凝胶中， 注射到芯片的不同腔室中进行 3D 培养。
图 5. 用 PRIMO 进行 PDMS 芯片微制造的原理示意图
3.3 应用： 芯片优化和 3D 细胞培养
图 6. 芯片设计优化和 PDMS 芯片成品。
（图 6A） 是最初的设计（根据 Kim et al.的文献【1】 ） ， 中间的通道可以注射细胞，两侧的通道既可以注射细胞也可以注射营养物质。
（图 6B 和 3C） 展示了更复杂的芯片设计， 加上了其他通道。
（图 6D） 显示的是 PDMS 芯片的成品， 特殊结构的 PDMS 芯片安装在玻璃载玻片上， 芯片通道的入口处设计了穿孔装置， 用来注射细胞进入不同的腔室。
图 7. 在微制造的芯片中进行 3D 细胞培养。
（图 7A） 显示 PDMS 芯片中在 3D 胶原蛋白/纤维蛋白水凝胶中培养的 HUVEC 细胞， 它们自发地形成了有功能的血管结构。
（图 7B） 显示该结构能够将荧光微珠从一个腔室传递到另一个腔室， 即具有功能性。
（图 7C） 最终， 研究者将不同类型的细胞注射到芯片的不同的腔室/管道里， 以重现造血干细胞的微生态环境： 顶部腔室里的成骨细胞模拟骨骼成分， 底部腔室里的 HUVEC 细胞模拟血管成分， 造血干细胞被注射进入中间的通道。
（四） 实验结论
因为可以基于图像进行无掩模的 UV 投射， PRIMO 是进行微制造快速建模的强有力工具，可以用于日常的灵活的创建新模型。 通过投射得到的 SU8 结构可以被用来作为模具， 创造PDMS 芯片， 各种细胞就可以在分割的腔室中进行 3D 生长。 研究者将 3 种不同的细胞在芯片的不同腔室里培养数日， 展示了这个芯片的极佳的生物相容性。 生成的类器官芯片被用来模拟造血干细胞的微生态环境。
（五） PRIMO 介绍
PRIMO 的芯片微制造（Microfabrication） 的实验原理可参考： 生物建模的黑科技——快捷精准的“定制化细胞微环境制备系统” （下） 。
5.1 PRIMO 的主要特点和优势【3】 ：
无掩模： 非接触式、 无掩模 UV 投射成像（波长λ =375nm） ， 可灵活控制 UV 的强度、 照射时间、 区域；
自动化： 全自动快速定制， 可针对实验条件进行快速优化；
高灵活性： 可按照任意图案去构建您的基质和/或使其功能化， 不限图案的大小和复杂程度， 生成不同的细胞模型；
多样性/兼容性： 适用于常规的细胞培养基质， 基质可为平面或有微结构， 可硬可软，如： 玻璃盖玻片、 塑料培养皿、 聚二甲基硅氧烷（PDMS） 、 聚苯乙烯、 水凝胶（PEG 丙烯酸酯、 聚丙烯酰胺凝胶、 琼脂、 基质胶） 、 光刻胶， 等；
常 用 蛋 白 ： 我 们 的 客 户 日 常 使 用 超 过 10 种 的 各 类 蛋 白 ： Fibrinogen-488,Fibrinogen-647, Fibronectin, GFP, Neutravidin-488, Neutravidin-647,PLL-PEG-Biotin, Protein A-647, Streptavidin, 初级和次级抗体， 等；
高分辨率： 全视野分辨率为 1.2µm（500× 300µm ， 20 倍物镜） ；
多层次： 可蚀刻 256 个灰阶层次， 粘附不同密度层次的蛋白；
多种蛋白： 可应用 3 种不同蛋白（根据实验需求） ；
自动对齐： 自动进行检测和图案定位， 可自动对齐于微结构或者微图案上；
速度快： 蚀刻 500× 300µm 图案， 20 倍物镜， 仅需 30s。
5.2 PRIMO 的应用领域
PRIMO 强大的生物建模能力和对细胞微环境的控制， 可以为多种生物学实验带来全新的、 突破性视角， 可用于研究细胞迁移/趋触性、 细胞黏附、 2D/3D 细胞标准化培养、 细胞球培养、 生物力学、 组织工程、 微流体芯片， 等多个领域。
（六） 附录
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参考文献：
【1】 Kim et al., Lab Chip, 2013, 13(8):1489-500.
【2】 Souquet B.,et.al.,Fast prototyping of organ-on-a-chip with PRIMO, Alveole Application Note.
【3】 Alveole 的官网： https://www.alveolelab.com/