细胞异质性研究新途径：原代肿瘤细胞的无标记单细胞分析

2020 年，前列腺癌占全球新发癌症病例的 7.3%，导致超过 37.5 万人死亡【1】。对该疾病的治疗仍有局限性，通常涉及雄激素剥夺治疗（ADT），最终导致耐药性【2】。最近药物的发展为治疗开辟了新的途径。然而，肿瘤学研究表现出对候选药物的高水平消耗，突出了在药物开发研究中建立更好的前列腺癌模型的必要性【3】。目前，药物发现的途径过度依赖已建立的细胞系，而这些细胞系不能充分反映前列腺癌复杂的、异质性的本质。这导致了在开发药物的过程中浪费时间和金钱，尤其是对于那些在下游测试中表现失败的药物。

从患者身上提取的原代细胞因为对目标癌症表现出更加生理准确的效果，所以能提供改善治疗发现结果的机会。它还为个人提供了个体化治疗的空间，与现代医学的进展相一致。
 
由于异质培养中复杂细胞信号通路的缺失，目前的前列腺癌细胞系无法准确地模拟前列腺肿瘤的行为【4】。患者肿瘤细胞之间的表型也可以以多种方式发生巨大差异，从遗传和表观遗传水平开始，逐步发展到多病灶性癌症和患者之间的变异。这种变化并没有反映在已建立的细胞系中——这强调了发展和筛查癌症治疗需要更复杂的细胞模型。

为了解决细胞系问题，约克大学的 Norman Maitland 教授的研究小组研究使用原代前列腺细胞来研究新的癌症治疗方法【5】。这使得他们能够研究肿瘤内的细胞相互作用，并表现不同的、更有临床相关性的癌症类型。
 
在分析原代前列腺癌细胞时，约克大学的研究者 Fiona Frame 博士和 Amanda Noble 博士发现，在异质性培养中已有的表征细胞的方法对于获得准确的数据并不理想。最初，他们将一群细胞暴露在假设的治疗中，然后将亚型进行单独的培养，这种方法劳动强度很大，并导致了细胞活性的变化【6】。另一种选择是通过荧光标记，这将导致因活性氧释放而引起的光毒性【7】。

他们尝试使用 Livecyte，一种无标记的高内涵动态细胞成像仪，利用其定量相位成像模式来识别异质性培养中的不同亚群。
 
Livecyte 使用 Ptychography（叠层衍射成像，一种定量相位成像技术）产生高对比度无标记的细胞培养图像。自动分析算法生成每个细胞的精确分割，使研究人员能够自动跟踪单个细胞，并提取有关它们行为的有价值的信息，如运动、增殖和干物质量（Dry Mass）。

利用 Livecyte，Frame 博士等人能够显示常用细胞系和原代细胞之间的行为差异【5】。这证实了在治疗方法开发过程中，肿瘤的异质性不能用单一细胞系来充分地表现。他们证明，原代细胞更大、更快，但干物质量和细胞数目的增加速度比细胞系低（图 1 和图 2 ）。这些生长和增殖方面的差异将影响实验处理产生效果所需要的时间。



图 1. Livecyte 成像显示，在 2D 培养中，原代前列腺细胞分裂的频率低于细胞系，但运动明显增加。一组前列腺细胞系与原代前列腺上皮培养物一起生长，并进行了延时成像。(A)每种细胞类型的明场图像；(B)每种细胞类型的Livecyte 图像与细胞分割轮廓（彩色线）和细胞跟踪 ID（彩色数字）显示；(C)每种细胞类型的跟踪的 2D 表示（X轴，x位置；Y轴，y位置）；(D)每种细胞类型的跟踪的 3D 表示（与 2D 类似，但包括 Z 轴，时间）。【5】



图 2.(E)每种细胞类型的平均细胞面积。每个点代表一个单独的细胞；(F)绘制每种细胞类型的平均速度。每个点代表一个单独的细胞；(G)绘制每帧延时视频的总干物质量，显示细胞的生长和增殖。【5】
 
该团队能够进一步区分来自原代培养的 Transit Amplification（TA）癌症祖细胞和 Committed Basal（CB） 分化细胞的亚群【5】。TA 细胞是肿瘤的活性成分，异常分化引起细胞积累，导致癌症生长【8】。在 Livecyte 上分析了分离的 TA 和 CB 细胞群的特征，发现 CB 细胞比 TA 细胞更不呈球形，体积和干物质量更大（图3）。根据这些发现，为这两种细胞类型开发了独特的细胞指纹，从而在无标记的情况下对异质培养中的 CB 和 TA 细胞进行了自动分类（图 4）。然后，该团队实时无标记观察异质性原代细胞对多西他赛（docetaxel）治疗的动态反应。这证明了从患者的活检肿瘤中快速筛查和个性化治疗前列腺癌具有可能性。



图 3.原代前列腺培养中两个细胞群的特征可以从 Livecyte 数据中得到表征，并用于识别异质性培养中的不同的细胞群。（A）TA 和 CB 细胞的 Livecyte 图像显示细胞分割轮廓（彩色线）。测量了每种细胞类型的 Livecyte 分析数据，包括（B）平均细胞面积，（C）平均细胞干物质量和（D）细胞球形度。【5】



图 4. （E）无标记分析混合培养的细胞，以及基于细胞面积分离出的两个细胞群的“圈门”应用。测量整个群体和各细胞类型的数据，并绘制成散点图表示平均细胞面积和平均细胞干物质量。【5】

Frame 博士等人发表的其他论述进一步研究了给予多西他赛剂量后原代细胞形态的变化【6】。随着细胞有丝分裂的中断，增加多西他赛剂量导致细胞运动速度和蜿蜒指数的下降，以及球形度的增加。该团队发现细胞球形中存在双峰和三峰反应，表明细胞的小亚群存在耐药性；一些细胞变平并死亡，而另一些细胞保持球形并存活下来（图5）。



图 5.从 Livecyte 数据中可以提取原代前列腺细胞对多西他赛的动态响应。每个细胞都被测量，并记录反应的模式。双峰球形度响应观察到一些参数，可以关联到细胞的一些行为（蓝绿色圆圈）。【6】

通过观察延时图像，可以识别出离群细胞。这些细胞移动更不稳定，在尝试有丝分裂时变成球形，分裂失败后继续移动。需要进一步的工作来证实这些异常细胞的耐药性，然而，如果情况是这样，就可以识别出最终可能导致治疗后癌症复发的那些特殊细胞。Livecyte 将每个细胞作为一个数据点，能够揭示更多的细节，而这些细节在用更传统的方法研究种群平均值时被掩盖了。

（六）结论

由于前列腺癌固有的变异性，单一细胞模型缺乏真实的异质性前列腺细胞培养中存在的复杂细胞信号通路和表型表现。更加复杂的、临床相关的细胞模型对于提高开发和筛查癌症治疗的疗效至关重要。然而，这种复杂性为表征细胞的行为提出了更大的挑战。

约克大学 Norman Maitland 教授的研究小组利用原代前列腺细胞研究新的癌症治疗方法。在对原代前列腺癌细胞的分析中，研究人员 Fiona Frame 博士和 Amanda Noble 博士确定了表征异质性培养的现有方法，如荧光标记或分离亚型，会导致细胞行为的改变。

然而，通过使用 Livecyte, Frame 博士和 Noble 博士能够进行长期的延时成像，同时使用内置的处理算法来自动分割和跟踪异质性前列腺细胞培养中的每个细胞。他们可以区分 TA 和 CB 分化细胞的亚群，并在共培养时分别量化它们的行为，以检验多西他赛的治疗效果。此外，他们使用 Livecyte 鉴定了原代细胞形态对多西他赛的双峰和三峰反应，指出一小部分细胞具有耐药性。

Livecyte 开启了癌症研究的可能性新领域，使研究者能够识别单个细胞对治疗的耐药性。此外，它使我们更接近进行疗法的快速筛查和癌症患者个性化治疗这个目标，这一前景将改善数百万癌症患者的预后状况。
 

• 什么是 Livecyte？

Livecyte「单细胞示踪及功能分析系统」采用专利的「叠层衍射实时定量成像技术」（Ptychographic QPI），可以在无标记、无高光毒性激光照射的情况下，产生高对比度、无伪影、可定量、高保真度的细胞图像，并对单个细胞进行自动识别、跟踪和定量，同时得到细胞群和单个细胞的长时间实时动态数据【9】。


图6. Livecyte「单细胞示踪及功能分析系统」【9】。


（八）Livecyte的主要特征【9】
 

• 无标记衍射成像：

1. 比起明场、相差成像，Livecyte 叠层衍射成像可实现媲美荧光的无标记高对比成像。
2. 无荧光标记下，对细胞伤害更小，适用于干细胞、神经细胞及原代细胞等较脆弱的细胞。
3. 如有需要，也可搭配最多七种荧光成像。

• 独特数据库与大数据筛选分析：

1. 独特数据展示与呈现，实验结果一目了然。
2. 可以实现多参数、多数据间的大数据筛选与比较，找出单一参数无法发现的细胞行为。
3. 多种类数据输出（原始数值、图像、影片、单细胞分割档案），可用第三方软件做灵活分析。

• 自动化单细胞分析+干物质量分析：

1. 可实现自动化分析，根据形态学和行为学特征对每颗细胞创建独特的表型指纹，省去繁复耗时的人工圈选步骤。
2. 可实现精确的单细胞分割、单细胞定量，得到每颗细胞的多种参数进行分析，其他产品少有可做到；参数如：细胞面积、厚度、球形度、长宽比、周长、移动速度、瞬时移动速度、移动方向、迁移蜿蜒指数（Meandering Index）、限制比率（Confinement Ratio）、位移、分裂指数、倍增时间，等。
3. 可做独特的干物质量（Dry Mass）分析、无标记细胞谱系示踪分析、无标记细胞共培养分析，其他产品少有可做到。

参考文献
【1】Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Laversanne M, Soerjomataram I, Jemal A, Bray F. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin. 2021 May;71(3):209-249. doi: 10.3322/caac.21660. Epub 2021 Feb 4. PMID: 33538338.
【2】Nakazawa M, Paller C, Kyprianou N. Mechanisms of Therapeutic Resistance in Prostate Cancer. Curr Oncol Rep. 2017 Feb;19(2):13. doi: 10.1007/s11912-017-0568-7. PMID: 28229393; PMCID: PMC5812366.
【3】D. L. Jardim, E. S. Groves, P. P. Breitfeld, R. Kurzrock, Factors associated with failure of oncology drugs in late-stage clinical development: A systematic review. Cancer Treat Rev 52, 12-21 (2017)
【4】Butler DE, Marlein C, Walker HF, Frame FM, Mann VM, Simms MS, Davies BR, Collins AT, Maitland NJ. Inhibition of the PI3K/AKT/mTOR pathway activates autophagy and compensatory Ras/Raf/MEK/ERK signalling in prostate cancer. Oncotarget 2017;8:56698-713.
【5】Frame FM, Noble AR, Klein S, Walker HF, Suman R, Kasprowicz R, Mann VM, Simms MS, Maitland NJ. Tumor heterogeneity and therapy resistance - implications for future treatments of prostate cancer. J Cancer Metastasis Treat 2017;3:302-14.
【6】Frame, Fiona M, Noble, Amanda R, O'Toole, Peter et al (2019) Assessing the Advantages, Limitations and Potential of Human Primary Prostate Epithelial Cells as a Pre-clinical Model for Prostate Cancer Research. Advances in experimental medicine and biology. pp. 109-118. ISSN 0065-2598
【7】Dixit R, Cyr R. 2003. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. Plant J 36:280–90
【8】Sell S. (2010). On the stem cell origin of cancer. The American journal of pathology, 176(6), 2584–2494. https://doi.org/10.2353/ajpath.2010.091064
【9】Phasefocus website：www.phasefocus.com
【10】Refer to: Mailand Case Study Final Report