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CAR-T 在体内的示踪研究变得如此便利
1746 人阅读发布时间：2021-04-09 15:03
（一） 宾大发表 CAR-T 示踪研究论文
宾夕法尼亚大学 Perelman 医学院通过使用 MOLECUBES PET/CT 模块化台式小动物成像系统， 2020 年 1 月在《Molecular Therapy》上发表了论文《Imaging CAR T CellTrafficking with eDHFR as a PET Reporter Gene》，揭示如何利用 PET/CT 进行小鼠体内的 CAR-T 示踪研究【1】。
图 1. 宾夕法尼亚大学发表的论文。
（二） 如何设计 PET 报告基因？
目前 CAR-T 和 TCR-T 细胞治疗已经越来越成熟，但我们如何知道此治疗细胞在体内到达了靶点，而非到达其他部位引发毒性反应？ 宾大的研究者设计出一种 PET 报告基因： [18F]-TMP-eDHFR（[18F]-TMP： 氟代甲氧苄胺嘧啶； eDHFR： 二氢叶酸还原酶）， TMP 和 eDHFR 的生化结构保证了小分子 TMP 和蛋白质 eDHFR 能相互作用，从而紧密结合在一起。将转染 DYR 质粒（DYR： eDHFR-YFR-Renilla； YFP：黄色荧光蛋白； Renilla luciferase：荧光素酶）的肿瘤细胞移植在小鼠体内，再从小鼠尾静脉注射[18F]-TMP， 特定时间后对小鼠进行 PET 成像，就可以显示出肿瘤细胞的位置。 同时荧光素酶的加入，使生物发光成像（BLI） 也成为可能。
图 2. PET 报告基因（[18F]-TMP-eDHFR）的结构。
如果用靶向 GD2（双唾液酸神经节苷酯）的 CAR 慢病毒和带 DYR 质粒的慢病毒同时转染 T细胞，就可以得到转染了 eDHFR 的 DYR-CAR T cell，注射 DYR-CAR T cell 到移植了 GD2+和 GD2-的肿瘤细胞的小鼠体内， 通过从小鼠尾静脉注射[18F]-TMP 核素， 就可以跟踪 CAR
T cell 是否靶向 GD2+的肿瘤细胞。 靶向 GD2+的 CAR-T 疗法， 可治疗儿科肿瘤如成神经细胞瘤和骨肉瘤。
图 3. DYR 质粒和 CAR 质粒示意图【1】。
（三） 主要实验结果
3.1 体内实验检测[18F]-TMP 和 eDHFR 的结合力方法： 表达 eDHFR-YFP 的 HCT116 cells（人结肠癌细胞） 和无转导（NTD） HCT116 cells
（对照组） 分别移植到 CD1 nu/nu 小鼠的双肩，生长 3 周（图 4， C 图）； [18F]-TMP 从尾静脉注射入小鼠体内； 注射后 3h 和 6h 进行 PET 成像（图 4， D 图和 E 图）。结论（1）： eDHFR tumor 摄取更多的[18F]-TMP；对照组基本无摄取。
图 4. 小鼠体内实验检测[18F]-TMP 和 eDHFR 的结合力【1】。
结论（2）： 小鼠不同脏器部位的放射信号强度表示[18F]-TMP 的摄入量：eDHFR tumor 摄取更多的[18F]-TMP，其他重要器官（如心脏、肌肉、 肺、 脾脏、脑部，等） 摄入低，灵长类骨髓、肠道摄入低（图 5， A 图）。肿瘤和肌肉的放射信号强度比表示： eDHFR tumor 明显高于 Control Tumor（图 5， B 图）。 说明此方法背景值低，方法灵敏。
图 5. 小鼠不同脏器部位的信号强度表示[18F]-TMP 的摄入量【1】。
3.2 体内实验显示 CAR T cell 的跟踪
用流式细胞仪可根据 YFP 和 mCherry 的不同表达分选出不同细胞群进行后续实验：
（1）双阳性 DYR-CAR T cell；
（2）单阳性的对照的 DYR-only T cell、 CAR-only T cell。
方法： 小鼠进行肩部皮下异体肿瘤移植： 小鼠：免疫缺陷的人源化的 NSG mice； 肿瘤为：GD2+肿瘤（143b 人骨肉瘤） 和 GD2-对照肿瘤（HCT116 人结肠癌细胞） 对比； 肿瘤生长 14天后从尾静脉注射 DYR-CAR T cell 或 control DYR-only T cell； 在 T cell 注射之后的第 7 天和第 13 天成像，开始是尾静脉注射腔肠素后进行生物发光成像（BLI），然后尾静脉注射[18F]-TMP 进行 PET/CT 成像。
图 6. 体内实验流程图【1】。
结论（1）： GD2+ 143b tumor 研究： DYR-CAR T cell 的比值在第 13 天增加，而 Control DYR T cell 的比值均未增加（图 7， D 图）。小鼠 M4： BLI 显示：第 7 天时脾脏有信号，在第 13 天时信号聚集在 GD2+ tumor 中； PET 显示：红色箭头为肿瘤内的 T cell 的聚集（图7， E 图）。 DYR-CAR T cell 聚集在 GD2+ tumor 中。
图 7. GD2+ 143b tumor 研究： DYR-CAR T cell 聚集在 GD2+ tumor 中【1】。
结论（2）： GD2- HCT116 tumor 研究： DYR-CAR T cell 的比值和 Control DYR T cell 的比值均未增加（图 8， F 图）。 小鼠 M3： BLI 显示：脾脏荧光第 13 天已减弱，信号出现在肿瘤上（图 8， A 图）； PET 显示： GD2+信号强， GD2-信号弱（图 8， B 图）。 DYR-CAR T cell
不会聚集在 GD2- tumor 中。
图 8. GD2- HCT116 tumor 研究： DYR-CAR T cell 不会聚集在 GD2- tumor 中【1】。
详细实验过程及结果，请参考原文。
（四） 实验的意义
本文开发了一种 PET 成像技术利用[18F]-TMP 和 eDHFR 作为报告基因进行 CAR T cell的追踪。
PET 成像信号来自： DYR-CAR T cells ， CAR 是 T cells 增殖和示踪的关键，可以检测仅有 11,000 CD8 DYR-CAR T cells per mm3 的肿瘤组织，方法灵敏度高于其他 PET 示踪技术， 如： human norepinephrine transporter (hNET) 和 herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-tk)。本方法可以对生物工程细胞进行长期（数周到数月）的追踪，是短期标记追踪技术（如 Zr-89 或 In-111 oxine）的有力补充。 【1】对人体内的少量基因改造细胞，如 CAR T cell 进行成像是加速从新细胞治疗技术到临床实践转化的关键。可加强我们对治疗成功、失败和毒性的理解和认知。
适合做 CAR T cell 示踪的 PET 必须具有高分辨率、高灵敏度、低剂量等优势。 比利时MOLECUBES PET/CT 模块化台式小动物分子影像系统是市面上为数不多满足这些要求的PET/CT 系统。
（五） MOLECUBES PET/CT 介绍
5.1 仪器技术介绍
MOLECUBES 成立于比利时根特大学（比利时学术排名第一）， 采用最先进的小动物活体成像技术/核医光电技术及光学材料，将原本体积巨大、笨重的 PET/SPECT/CT 仪器设计成结构紧凑、运输安装方便的台面式仪器，同时提供业界领先的高分辨率和高灵敏度，是市面上唯一可做整只大鼠全身成像的桌面式 PET/SPECT/CT【 2】。
图 9. MOLECUBES 的模块化台式小动物 PET/CT。
MOLECUBES 为模块化设计， PET、 SPECT、 CT 为独立的仪器。 PET、 SPECT 为功能性成像，CT 为结构性成像，可组成 PET-CT、 SPECT-CT、 PET-SPECT-CT 等多种模态，同时提供功能性和结构性信息。
模块化的优势有： 各模块具有最优功能表现、图像完美自动配准、速度快、通量高、可任意升级组合、维修不影响其他模块、占地小、安装易、运输方便，等。
MOLECUBES PET/SPECT/CT 的优势及特点有【2】 ：
1、 PET 采用先进的连续型单体闪烁晶体和 SiPM 耦合技术，和临床 PET 趋势一致； NEMA数据（空间分辨率、能量分辨率、灵敏度，等）业界最佳【3】 。
2、 SPECT 具有专利的准直器，高分辨率、高灵敏度，可使用三种不同放射核素同时成像。
3、 CT 为 360 度滑环结构，和临床 CT 趋势一致；可以极低放射剂量扫描。
4、都可做高通量扫描（同时 4 只小鼠）。
5、操作步骤在 10 步以内，简单易学。
6、 2016 年投产以来已在全球销售 60+台，远超其他同类产品。
PET 探测器技术采用连续型单体闪烁晶体与硅光电倍增器系统相耦合 ( LYSO cont./SiPM)：即晶体为整体材料，无需由多个小晶体拼接而成，单晶使探测器能够更准确的获得光子在闪烁晶体中能量沉积的位置与时间(DOI， Depth of Interaction)， 具有更高的光子探测效率，提高系统的空间分辨率、时间分辨率、灵敏度，进而提高系统的成像质量。与临床 PET 的发展方向保持一致。 而其他品牌的 PET 仍然采用传统的像素化多晶体，分辨率有限，灵敏度低，成本高。此外，硅光电倍增器（SiPM）与光电倍增管（PMT）相比，能在更低的电压下提供更高的增益和更快的反应，光电转化效率更高，是更新、更先进的技术（图10） 。 MOLECUBES 使用的连续型单晶体具有全球最高光子吸收效率【2】 。
图 10. 连续型单体闪烁晶体和 SiPM 耦合（左图），像素型多晶体和 PMT 耦合（右图）。
根据 NEMA 行业标准（NEMA 即美国电气制造商协会， 成立于 1926 年， 由美国 560 家主要电气制造厂商组成， NEMA 行业标准为不同生产商生产的设备提供一个国际公认的比较标准）， MOELCUBES 的 PET 具有以下优势【3】 ：
（1） 单床 FOV 可做整只大/小鼠的全身扫描成像；
（2） 极佳的空间分辨率： 在径向上均匀一致的亚毫米级别（0.9mm） ；
（3） 极佳的峰值灵敏度： 12.4% (255-765 keV)；
（4） 极佳的能量分辨率： 12%；
（5） 在 散射 分数 （ scatter fraction ） 、 对比 恢复系 数（ contrast recoverycoefficient， CRC） 、溢出比率（spill-over ratio， SOR） 等指标上也优于同类产品。
图 11. PET 单床 FOV 可做整只小鼠的全身成像， 高通量成像可同时做 4 只小鼠。
图 12. PET 单床 FOV 和 SPECT 多床 FOV 可做整只大鼠的全身成像。
图 13.高分辨率 PET，可观察到细微结构，如斑马鱼的脊柱、小鼠肺泡上的肿瘤、小鼠的纹状体和心脏的乳头状肌结构【2】 。
图 14.因为有高分辨率和高灵敏度， PET 可以极低放射剂量成像。
MOLECUBES 的 CT 也具有低放射剂量和快速成像功能，同时保证极佳的分辨率。
图 15.在噪声调整技术下的极低放射剂量和快速 CT 成像：仅需 2.8mGy 和 25s【2】 。
软件设计友好，用户使用界面简单直观， 整个软件操作在 10 步以内，任何研究人员在半天的培训后都可以进行仪器操作成像。
5.2 PET/CT 应用举例
图 16.药物代谢研究： 20min 动态 PET/CT 图像，药物对肝脏有毒性，不能残留在肝脏里，动态成像最后肝脏不亮，说明没有药物残留【2】 。
（六） 附录
更 多资讯， 请联系： 森西 赛智科技 有限公司 ，电 话： 010-61666616，邮 箱：info@sinsitech.com，网址： www.sinsitech.com。
参考文献：
【1】 Sellmyer,M.A.,et.al., Imaging CAR T Cell Trafficking with eDHFR as a PETReporter Gene, Molecular Therapy, Vol28, No.1, January 2020.
【2】 Molecubes website: www.molecubes.com
【3】 NEMA paper: Performance evaluation of the MOLECUBES β -CUBE——a high spatial resolution and high sensitivity small animal PET scanner utilizing monolithic LYSO scintillation detectors, Physics in Medicine & Biology. 63(2018) 155013(12pp).
宾夕法尼亚大学 Perelman 医学院通过使用 MOLECUBES PET/CT 模块化台式小动物成像系统， 2020 年 1 月在《Molecular Therapy》上发表了论文《Imaging CAR T CellTrafficking with eDHFR as a PET Reporter Gene》，揭示如何利用 PET/CT 进行小鼠体内的 CAR-T 示踪研究【1】。
图 1. 宾夕法尼亚大学发表的论文。
（二） 如何设计 PET 报告基因？
目前 CAR-T 和 TCR-T 细胞治疗已经越来越成熟，但我们如何知道此治疗细胞在体内到达了靶点，而非到达其他部位引发毒性反应？ 宾大的研究者设计出一种 PET 报告基因： [18F]-TMP-eDHFR（[18F]-TMP： 氟代甲氧苄胺嘧啶； eDHFR： 二氢叶酸还原酶）， TMP 和 eDHFR 的生化结构保证了小分子 TMP 和蛋白质 eDHFR 能相互作用，从而紧密结合在一起。将转染 DYR 质粒（DYR： eDHFR-YFR-Renilla； YFP：黄色荧光蛋白； Renilla luciferase：荧光素酶）的肿瘤细胞移植在小鼠体内，再从小鼠尾静脉注射[18F]-TMP， 特定时间后对小鼠进行 PET 成像，就可以显示出肿瘤细胞的位置。 同时荧光素酶的加入，使生物发光成像（BLI） 也成为可能。
图 2. PET 报告基因（[18F]-TMP-eDHFR）的结构。
如果用靶向 GD2（双唾液酸神经节苷酯）的 CAR 慢病毒和带 DYR 质粒的慢病毒同时转染 T细胞，就可以得到转染了 eDHFR 的 DYR-CAR T cell，注射 DYR-CAR T cell 到移植了 GD2+和 GD2-的肿瘤细胞的小鼠体内， 通过从小鼠尾静脉注射[18F]-TMP 核素， 就可以跟踪 CAR
T cell 是否靶向 GD2+的肿瘤细胞。 靶向 GD2+的 CAR-T 疗法， 可治疗儿科肿瘤如成神经细胞瘤和骨肉瘤。
图 3. DYR 质粒和 CAR 质粒示意图【1】。
（三） 主要实验结果
3.1 体内实验检测[18F]-TMP 和 eDHFR 的结合力方法： 表达 eDHFR-YFP 的 HCT116 cells（人结肠癌细胞） 和无转导（NTD） HCT116 cells
（对照组） 分别移植到 CD1 nu/nu 小鼠的双肩，生长 3 周（图 4， C 图）； [18F]-TMP 从尾静脉注射入小鼠体内； 注射后 3h 和 6h 进行 PET 成像（图 4， D 图和 E 图）。结论（1）： eDHFR tumor 摄取更多的[18F]-TMP；对照组基本无摄取。
图 4. 小鼠体内实验检测[18F]-TMP 和 eDHFR 的结合力【1】。
结论（2）： 小鼠不同脏器部位的放射信号强度表示[18F]-TMP 的摄入量：eDHFR tumor 摄取更多的[18F]-TMP，其他重要器官（如心脏、肌肉、 肺、 脾脏、脑部，等） 摄入低，灵长类骨髓、肠道摄入低（图 5， A 图）。肿瘤和肌肉的放射信号强度比表示： eDHFR tumor 明显高于 Control Tumor（图 5， B 图）。 说明此方法背景值低，方法灵敏。
图 5. 小鼠不同脏器部位的信号强度表示[18F]-TMP 的摄入量【1】。
3.2 体内实验显示 CAR T cell 的跟踪
用流式细胞仪可根据 YFP 和 mCherry 的不同表达分选出不同细胞群进行后续实验：
（1）双阳性 DYR-CAR T cell；
（2）单阳性的对照的 DYR-only T cell、 CAR-only T cell。
方法： 小鼠进行肩部皮下异体肿瘤移植： 小鼠：免疫缺陷的人源化的 NSG mice； 肿瘤为：GD2+肿瘤（143b 人骨肉瘤） 和 GD2-对照肿瘤（HCT116 人结肠癌细胞） 对比； 肿瘤生长 14天后从尾静脉注射 DYR-CAR T cell 或 control DYR-only T cell； 在 T cell 注射之后的第 7 天和第 13 天成像，开始是尾静脉注射腔肠素后进行生物发光成像（BLI），然后尾静脉注射[18F]-TMP 进行 PET/CT 成像。
图 6. 体内实验流程图【1】。
结论（1）： GD2+ 143b tumor 研究： DYR-CAR T cell 的比值在第 13 天增加，而 Control DYR T cell 的比值均未增加（图 7， D 图）。小鼠 M4： BLI 显示：第 7 天时脾脏有信号，在第 13 天时信号聚集在 GD2+ tumor 中； PET 显示：红色箭头为肿瘤内的 T cell 的聚集（图7， E 图）。 DYR-CAR T cell 聚集在 GD2+ tumor 中。
图 7. GD2+ 143b tumor 研究： DYR-CAR T cell 聚集在 GD2+ tumor 中【1】。
结论（2）： GD2- HCT116 tumor 研究： DYR-CAR T cell 的比值和 Control DYR T cell 的比值均未增加（图 8， F 图）。 小鼠 M3： BLI 显示：脾脏荧光第 13 天已减弱，信号出现在肿瘤上（图 8， A 图）； PET 显示： GD2+信号强， GD2-信号弱（图 8， B 图）。 DYR-CAR T cell
不会聚集在 GD2- tumor 中。
图 8. GD2- HCT116 tumor 研究： DYR-CAR T cell 不会聚集在 GD2- tumor 中【1】。
详细实验过程及结果，请参考原文。
（四） 实验的意义
本文开发了一种 PET 成像技术利用[18F]-TMP 和 eDHFR 作为报告基因进行 CAR T cell的追踪。
PET 成像信号来自： DYR-CAR T cells ， CAR 是 T cells 增殖和示踪的关键，可以检测仅有 11,000 CD8 DYR-CAR T cells per mm3 的肿瘤组织，方法灵敏度高于其他 PET 示踪技术， 如： human norepinephrine transporter (hNET) 和 herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-tk)。本方法可以对生物工程细胞进行长期（数周到数月）的追踪，是短期标记追踪技术（如 Zr-89 或 In-111 oxine）的有力补充。 【1】对人体内的少量基因改造细胞，如 CAR T cell 进行成像是加速从新细胞治疗技术到临床实践转化的关键。可加强我们对治疗成功、失败和毒性的理解和认知。
适合做 CAR T cell 示踪的 PET 必须具有高分辨率、高灵敏度、低剂量等优势。 比利时MOLECUBES PET/CT 模块化台式小动物分子影像系统是市面上为数不多满足这些要求的PET/CT 系统。
（五） MOLECUBES PET/CT 介绍
5.1 仪器技术介绍
MOLECUBES 成立于比利时根特大学（比利时学术排名第一）， 采用最先进的小动物活体成像技术/核医光电技术及光学材料，将原本体积巨大、笨重的 PET/SPECT/CT 仪器设计成结构紧凑、运输安装方便的台面式仪器，同时提供业界领先的高分辨率和高灵敏度，是市面上唯一可做整只大鼠全身成像的桌面式 PET/SPECT/CT【 2】。
图 9. MOLECUBES 的模块化台式小动物 PET/CT。
MOLECUBES 为模块化设计， PET、 SPECT、 CT 为独立的仪器。 PET、 SPECT 为功能性成像，CT 为结构性成像，可组成 PET-CT、 SPECT-CT、 PET-SPECT-CT 等多种模态，同时提供功能性和结构性信息。
模块化的优势有： 各模块具有最优功能表现、图像完美自动配准、速度快、通量高、可任意升级组合、维修不影响其他模块、占地小、安装易、运输方便，等。
MOLECUBES PET/SPECT/CT 的优势及特点有【2】 ：
1、 PET 采用先进的连续型单体闪烁晶体和 SiPM 耦合技术，和临床 PET 趋势一致； NEMA数据（空间分辨率、能量分辨率、灵敏度，等）业界最佳【3】 。
2、 SPECT 具有专利的准直器，高分辨率、高灵敏度，可使用三种不同放射核素同时成像。
3、 CT 为 360 度滑环结构，和临床 CT 趋势一致；可以极低放射剂量扫描。
4、都可做高通量扫描（同时 4 只小鼠）。
5、操作步骤在 10 步以内，简单易学。
6、 2016 年投产以来已在全球销售 60+台，远超其他同类产品。
PET 探测器技术采用连续型单体闪烁晶体与硅光电倍增器系统相耦合 ( LYSO cont./SiPM)：即晶体为整体材料，无需由多个小晶体拼接而成，单晶使探测器能够更准确的获得光子在闪烁晶体中能量沉积的位置与时间(DOI， Depth of Interaction)， 具有更高的光子探测效率，提高系统的空间分辨率、时间分辨率、灵敏度，进而提高系统的成像质量。与临床 PET 的发展方向保持一致。 而其他品牌的 PET 仍然采用传统的像素化多晶体，分辨率有限，灵敏度低，成本高。此外，硅光电倍增器（SiPM）与光电倍增管（PMT）相比，能在更低的电压下提供更高的增益和更快的反应，光电转化效率更高，是更新、更先进的技术（图10） 。 MOLECUBES 使用的连续型单晶体具有全球最高光子吸收效率【2】 。
图 10. 连续型单体闪烁晶体和 SiPM 耦合（左图），像素型多晶体和 PMT 耦合（右图）。
根据 NEMA 行业标准（NEMA 即美国电气制造商协会， 成立于 1926 年， 由美国 560 家主要电气制造厂商组成， NEMA 行业标准为不同生产商生产的设备提供一个国际公认的比较标准）， MOELCUBES 的 PET 具有以下优势【3】 ：
（1） 单床 FOV 可做整只大/小鼠的全身扫描成像；
（2） 极佳的空间分辨率： 在径向上均匀一致的亚毫米级别（0.9mm） ；
（3） 极佳的峰值灵敏度： 12.4% (255-765 keV)；
（4） 极佳的能量分辨率： 12%；
（5） 在 散射 分数 （ scatter fraction ） 、 对比 恢复系 数（ contrast recoverycoefficient， CRC） 、溢出比率（spill-over ratio， SOR） 等指标上也优于同类产品。
图 11. PET 单床 FOV 可做整只小鼠的全身成像， 高通量成像可同时做 4 只小鼠。
图 12. PET 单床 FOV 和 SPECT 多床 FOV 可做整只大鼠的全身成像。
图 13.高分辨率 PET，可观察到细微结构，如斑马鱼的脊柱、小鼠肺泡上的肿瘤、小鼠的纹状体和心脏的乳头状肌结构【2】 。
图 14.因为有高分辨率和高灵敏度， PET 可以极低放射剂量成像。
MOLECUBES 的 CT 也具有低放射剂量和快速成像功能，同时保证极佳的分辨率。
图 15.在噪声调整技术下的极低放射剂量和快速 CT 成像：仅需 2.8mGy 和 25s【2】 。
软件设计友好，用户使用界面简单直观， 整个软件操作在 10 步以内，任何研究人员在半天的培训后都可以进行仪器操作成像。
5.2 PET/CT 应用举例
图 16.药物代谢研究： 20min 动态 PET/CT 图像，药物对肝脏有毒性，不能残留在肝脏里，动态成像最后肝脏不亮，说明没有药物残留【2】 。
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参考文献：
【1】 Sellmyer,M.A.,et.al., Imaging CAR T Cell Trafficking with eDHFR as a PETReporter Gene, Molecular Therapy, Vol28, No.1, January 2020.
【2】 Molecubes website: www.molecubes.com
【3】 NEMA paper: Performance evaluation of the MOLECUBES β -CUBE——a high spatial resolution and high sensitivity small animal PET scanner utilizing monolithic LYSO scintillation detectors, Physics in Medicine & Biology. 63(2018) 155013(12pp).
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