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技术资料/正文
PRIMO 各种应用的汇总FAQ1
410 人阅读发布时间：2020-11-10 15:01
PRIMO 各种应用的FAQ汇总
森西万通科技（北京）有限公司
注：以下内容来自：
https://www.alveolelab.com/resources-support-center/faq/
注：以下FAQ内容来源于：
https://www.alveolelab.com/faq_topic/photopatterning-with-primo/
问1：与其他微图案化（Micropatterning）技术相比，PRIMO的光照图案化（Photopatterning）技术的优势有哪些？
答：PRIMO的解决方案给研究者提供实验操作的完全的自由度和全面的控制，使其可以很容易的优化实验条件。PRIMO可以快速建立任意形状的蛋白图案，以便精确的匹配或重叠不同的蛋白（可以无限制的使用多达3种蛋白，取决于使用的蛋白的种类和它们的相互作用），并控制吸附在基质上的局部的蛋白的密度。
问2：PRIMO可用于哪些应用？
答：（1）基质上的2D光图案化（2D photopatterning on substrate）；
（2）3D微结构上的光图案化（Photopatterning on 3D microstructures）；
（3）微制造（Microfabrication），如微流道芯片(microfluidic chip)制造。
问3：用PRIMO解决方案创建一个蛋白图案要多少时间？
答：创建一个图案（不包括图案设计步骤）的总体时间大概在10-15min。光照的时间各不相同，并且必须根据投射的图案和使用的物镜进行优化。在每次用UV照射并降解抗污聚合物涂层（anti-fouling polymer）（抗粘附）的步骤之后，都需要大概5min以便蛋白能吸附在图案上（时间随着放置在基质上的蛋白浓度的不同而变化）。
问4：细胞图案能稳定多久？
答：细胞图案的稳定的时间长度取决于使用的基质和培养的细胞类型。在一定的条件下，细胞能粘附在蛋白图案上长达2周。我们的研发团队会定期开发一些新的实验步骤供我们的用户选择。
问5：用PRIMO能否在水凝胶上打印出蛋白图案？
答：我们建议采取转移的技术（transfer technique），用PRIMO在载玻片上打印蛋白图案，再将载玻片放置在水凝胶上然后移除。如果用UV照射将蛋白光图案化到水凝胶上，往往会改变水凝胶的物理特性，然后改变一开始设定的实验条件。
问6：载玻片能提前包被吗？
答：我们推荐在同一天进行蛋白包被。然而，我们的研发团队也针对特定的基质定期开发新的实验方案，使保存用蛋白包被好的载玻片以供后用成为可能。
问7：为什么表面处理对于光照图案法很重要？
答：光照图案法是一个“减法”技术。它的首要目标是使用抗污聚合物包被基质，这样可以防止分子和细胞的粘附。然后在UV光和光活化试剂（PLPP）的共同作用下，使用PRIMO系统来局部降解这个抗粘附表层。
问8：PRIMO能允许在无菌的条件下进行实验吗？
答：可以。用PRIMO操作的实验可以在无菌的环境下进行，即使PRIMO仪器没有设置在无菌的房间中。这时，我们推荐在生物安全柜（BSC）中进行所有的洗涤和培养步骤，然后将样本放入一个封闭的培养板，然后放到PRIMO仪器的电动载物台上。
问9：PRIMO能用来在3D结构上打印蛋白图案吗？
答：PRIMO可用来在各种表面上打印图案，无论是否是平的、卷曲的或是有微结构的。例如，它可以将蛋白打印在微孔板的孔壁上，或PDMS的微柱上。可以按需提供这些内部数据。
问10：是否总是将光活化PLPP试剂和PRIMO配套使用？
答：PLPP可以加速光图像化过程中，抗污聚合物的降解作用（只需几秒钟，而不是几小时）。然而，使用SU8树脂或NOA进行微制造（microfabrication）操作是不需要使用PLPP的，因为这些材料在PRIMO光波长（375nm）下是光敏感的。
问11：在基质上需要进行什么样的抗污聚合物表面处理？
答：我们推荐使用PLL-PEG聚合物。我们定期开发新的实验方法以促进表面包被层的稳定性。
问12：仪器的视野的深度有多少？
答：当使用20x物镜时，激光穿透透明基质的视野的深度大概是200-300µm。
问13：仪器的分辨率有多少？
答：当使用20x物镜时，在大概500x300µm的视野中，整个视野的分辨率是1.2µm。
问14：能做的最大图案尺寸是多少？
答：PRIMO可以做任意尺寸的图案，没有大小限制。
问15：用PRIMO仪器哪些蛋白可以被图案化？
答：我们的团队和用户使用超过10种不同的蛋白，包括：Fibrinogen-488、Fibrinogen‐647、Fibronectin、GFP、Neutravidin‐488、Neutravidin‐647、PLL‐PEG‐Biotin、Protein A‐647、Streptavidin，和初级、次级抗体。
问16：用PRIMO仪器，哪些基质可以用来进行蛋白的光图像化操作？
答：PRIMO可用来对各种标准细胞培养基质进行图案化，包括：PDMS、玻璃、塑料、NOA、SU8。我们的研发团队也在定期测试和验证新的基质。可以按需提供这些内部数据。
问17：用PRIMO进行微制造（Microfabrication）时，需要用到哪些光阻材料（Photoresist）？
答：所有在375nm下敏感的光阻材料都可以与PRIMO配套使用。我们的研发团队主要用SU8光阻材料。
注：以下FAQ内容来源于：
https://www.alveolelab.com/faq_topic/primo-micropatterning-cryoet/
可参考：https://www.alveolelab.com/applications/cryo-em-grid-micropatterning/
问1：使用PRIMO准备Cryo-ET（冷冻电镜）细胞样本有什么不同？
答：PRIMO无掩膜微图案系统（maskless micropatterning system）可以用来控制细胞的粘附。因此，它能保证多个细胞精确地定位在电镜网格中（一般在网格的网眼正方形的中央）。而且，它能使您完全控制创建的微图案的设计。正如我们用户的研究论文所述，您可以控制细胞的形状、极性、伸展性，以便进行：
问2：PRIMO微图案法技术和所有电镜网格（EM grids）都兼容吗？
答：目前为止，我们检测了不同的网格材料，我们可以确定PRIMO微图案系统可以用于由碳膜、SiO2膜、硅氮化物膜（Silicon Nitride film）组成的网格，可以包含或不包含网眼。作为一种无掩膜微图案法技术，它可以与所有经典的电镜网格兼容。如果您想查证它是否和您的网格模型兼容，可以联系我们。
问3：能否检测我使用的透射电镜网格（TEM grids）是否可使用PRIMO？
答：我们可以提供多种选择来检测PRIMO微图案系统。您可以联系我们来讨论您的cryo-ET实验，以便发现检测PRIMO的最好的解决办法。
问4：PRIMO系统可以透过膜进行微图案化（micropatterning）吗？
答：使用UV光穿透网格的膜进行微图案设计是可行的，因为膜是透明的。如果您想在网眼中进行图案设计，要确保放在电动载物台（the motorized stage of the setup）上的网格是上下颠倒的（需要设计的膜的一面朝向物镜一侧）。
问5：我怎么确定我设计的微图案处在电镜网格的网眼范围内？
答：Leonardo photopatterning software可以自动检测电镜网格的网眼。然后可以将微图案定位于其中，并调整图案尺寸使其完美契合。当然，Leonardo software也能进行预期结果的预览，因此您能在进行微图案化操作之前进行任何手动的修改。
问6：准备微图案化的电镜网格的过程需要多久？
答：每天您可生成5-15个微图案化的电镜网格，包括了从anti-fouling coating到protein incubation的所有步骤。
问7：操作电镜网格是一个精细的步骤，看上去这个过程增加了更多的操作步骤，有没有解决办法呢？
答：的确，微图案化的过程增加了更多的操作步骤，但是经过培训，您将学会如何进行微图案化操作而不会损坏电镜网格。进一步而言，我们能开发特定的PDMS stencils（PDMS模板），可以将网格放置在盖玻片（或其他物品）上，并在整个操作流程中保持其位置不动，以减少对网格的操作。
问8：用PRIMO系统在电镜网格上得到的微图案的分辨率是多少？
答：用PRIMO无掩膜微图案系统在电镜网格中得到的微图案的分辨率是1.2µm，与在玻璃上得到的分辨率一致。
问9：能否在种植细胞之前保存已经进行微图案化的网格，能保存多久？
答：可以，在吸附蛋白之前，准备好的电镜网格可以在PBS溶液中保存一个月。
问10：PEG覆盖层的厚度是多少？
答：PEG覆盖层的厚度大概是5nm。
问11：在电镜网格微图案化之后，什么样的细胞可以种植上去？
答：与在玻璃上进行微图案化操作一样，经典的哺乳动物贴壁细胞可以种植在TEM网格的微图案上。目前为止，我们团队和用户已经成功操作的细胞包括：HeLa细胞、成纤维细胞（fibroblasts）、内皮细胞（epithelial cells）、MDCKⅡ、PtK1。
问12：微图案化对细胞的状态和功能的影响如何？
答：通过控制细胞粘附，微图案化对它们的功能和行为有一定的影响。因为能建立更受控的、重现性更强的体外生化微环境，微图案法能在更加生理相关的条件下研究活细胞（Thery, Journal of Cell Science,2010）
问13：有没有利用你们的技术进行Cryo-ET研究的论文可供参考？
答：有的，您可以参考以下论文：
【1】M. Toro-Nahuelpan et.al., Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies, Nature Methods, 17, pp.50–54 (2020), https://doi.org/10.1038/s41592-019-0630-5 (Julia Mahamid's lab, EMBL)
【2】L. Engel et.al., Extracellular matrix micropatterning technology for whole cell cryogenic electron microscopy studies, Journal of Micromechanics and Microengineering, Volume 29, Number 11 (2019), https://doi.org/10.1088/1361-6439/ab419a (Beth Pruitt's lab, Stanford University, UC Santa Barbara)
【3】L. Engel et.al., Lattice micropatterning of electron microscopy grids for improved cellular cryo-electron tomography throughput, BioRxiv, posted Aug 31,2020, doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.30.272237 (Alexander Dunn's lab, Stanford University)
森西万通科技（北京）有限公司
注：以下内容来自：
https://www.alveolelab.com/resources-support-center/faq/
- 用PRIMO进行光照图案化（Photopatterning）的FAQ
注：以下FAQ内容来源于：
https://www.alveolelab.com/faq_topic/photopatterning-with-primo/
问1：与其他微图案化（Micropatterning）技术相比，PRIMO的光照图案化（Photopatterning）技术的优势有哪些？
答：PRIMO的解决方案给研究者提供实验操作的完全的自由度和全面的控制，使其可以很容易的优化实验条件。PRIMO可以快速建立任意形状的蛋白图案，以便精确的匹配或重叠不同的蛋白（可以无限制的使用多达3种蛋白，取决于使用的蛋白的种类和它们的相互作用），并控制吸附在基质上的局部的蛋白的密度。
问2：PRIMO可用于哪些应用？
答：（1）基质上的2D光图案化（2D photopatterning on substrate）；
（2）3D微结构上的光图案化（Photopatterning on 3D microstructures）；
（3）微制造（Microfabrication），如微流道芯片(microfluidic chip)制造。
问3：用PRIMO解决方案创建一个蛋白图案要多少时间？
答：创建一个图案（不包括图案设计步骤）的总体时间大概在10-15min。光照的时间各不相同，并且必须根据投射的图案和使用的物镜进行优化。在每次用UV照射并降解抗污聚合物涂层（anti-fouling polymer）（抗粘附）的步骤之后，都需要大概5min以便蛋白能吸附在图案上（时间随着放置在基质上的蛋白浓度的不同而变化）。
问4：细胞图案能稳定多久？
答：细胞图案的稳定的时间长度取决于使用的基质和培养的细胞类型。在一定的条件下，细胞能粘附在蛋白图案上长达2周。我们的研发团队会定期开发一些新的实验步骤供我们的用户选择。
问5：用PRIMO能否在水凝胶上打印出蛋白图案？
答：我们建议采取转移的技术（transfer technique），用PRIMO在载玻片上打印蛋白图案，再将载玻片放置在水凝胶上然后移除。如果用UV照射将蛋白光图案化到水凝胶上，往往会改变水凝胶的物理特性，然后改变一开始设定的实验条件。
问6：载玻片能提前包被吗？
答：我们推荐在同一天进行蛋白包被。然而，我们的研发团队也针对特定的基质定期开发新的实验方案，使保存用蛋白包被好的载玻片以供后用成为可能。
问7：为什么表面处理对于光照图案法很重要？
答：光照图案法是一个“减法”技术。它的首要目标是使用抗污聚合物包被基质，这样可以防止分子和细胞的粘附。然后在UV光和光活化试剂（PLPP）的共同作用下，使用PRIMO系统来局部降解这个抗粘附表层。
问8：PRIMO能允许在无菌的条件下进行实验吗？
答：可以。用PRIMO操作的实验可以在无菌的环境下进行，即使PRIMO仪器没有设置在无菌的房间中。这时，我们推荐在生物安全柜（BSC）中进行所有的洗涤和培养步骤，然后将样本放入一个封闭的培养板，然后放到PRIMO仪器的电动载物台上。
问9：PRIMO能用来在3D结构上打印蛋白图案吗？
答：PRIMO可用来在各种表面上打印图案，无论是否是平的、卷曲的或是有微结构的。例如，它可以将蛋白打印在微孔板的孔壁上，或PDMS的微柱上。可以按需提供这些内部数据。
问10：是否总是将光活化PLPP试剂和PRIMO配套使用？
答：PLPP可以加速光图像化过程中，抗污聚合物的降解作用（只需几秒钟，而不是几小时）。然而，使用SU8树脂或NOA进行微制造（microfabrication）操作是不需要使用PLPP的，因为这些材料在PRIMO光波长（375nm）下是光敏感的。
问11：在基质上需要进行什么样的抗污聚合物表面处理？
答：我们推荐使用PLL-PEG聚合物。我们定期开发新的实验方法以促进表面包被层的稳定性。
问12：仪器的视野的深度有多少？
答：当使用20x物镜时，激光穿透透明基质的视野的深度大概是200-300µm。
问13：仪器的分辨率有多少？
答：当使用20x物镜时，在大概500x300µm的视野中，整个视野的分辨率是1.2µm。
问14：能做的最大图案尺寸是多少？
答：PRIMO可以做任意尺寸的图案，没有大小限制。
问15：用PRIMO仪器哪些蛋白可以被图案化？
答：我们的团队和用户使用超过10种不同的蛋白，包括：Fibrinogen-488、Fibrinogen‐647、Fibronectin、GFP、Neutravidin‐488、Neutravidin‐647、PLL‐PEG‐Biotin、Protein A‐647、Streptavidin，和初级、次级抗体。
问16：用PRIMO仪器，哪些基质可以用来进行蛋白的光图像化操作？
答：PRIMO可用来对各种标准细胞培养基质进行图案化，包括：PDMS、玻璃、塑料、NOA、SU8。我们的研发团队也在定期测试和验证新的基质。可以按需提供这些内部数据。
问17：用PRIMO进行微制造（Microfabrication）时，需要用到哪些光阻材料（Photoresist）？
答：所有在375nm下敏感的光阻材料都可以与PRIMO配套使用。我们的研发团队主要用SU8光阻材料。
- PRIMO表面蛋白涂层法/微图案法（micropatterning）进行Cryo-ET成像FAQ
注：以下FAQ内容来源于：
https://www.alveolelab.com/faq_topic/primo-micropatterning-cryoet/
可参考：https://www.alveolelab.com/applications/cryo-em-grid-micropatterning/
问1：使用PRIMO准备Cryo-ET（冷冻电镜）细胞样本有什么不同？
答：PRIMO无掩膜微图案系统（maskless micropatterning system）可以用来控制细胞的粘附。因此，它能保证多个细胞精确地定位在电镜网格中（一般在网格的网眼正方形的中央）。而且，它能使您完全控制创建的微图案的设计。正如我们用户的研究论文所述，您可以控制细胞的形状、极性、伸展性，以便进行：
- 生物力学研究；
- 帮助进行FIB milling操作；
- 保证重复性和更有效的cryo-ET成像。
问2：PRIMO微图案法技术和所有电镜网格（EM grids）都兼容吗？
答：目前为止，我们检测了不同的网格材料，我们可以确定PRIMO微图案系统可以用于由碳膜、SiO2膜、硅氮化物膜（Silicon Nitride film）组成的网格，可以包含或不包含网眼。作为一种无掩膜微图案法技术，它可以与所有经典的电镜网格兼容。如果您想查证它是否和您的网格模型兼容，可以联系我们。
问3：能否检测我使用的透射电镜网格（TEM grids）是否可使用PRIMO？
答：我们可以提供多种选择来检测PRIMO微图案系统。您可以联系我们来讨论您的cryo-ET实验，以便发现检测PRIMO的最好的解决办法。
问4：PRIMO系统可以透过膜进行微图案化（micropatterning）吗？
答：使用UV光穿透网格的膜进行微图案设计是可行的，因为膜是透明的。如果您想在网眼中进行图案设计，要确保放在电动载物台（the motorized stage of the setup）上的网格是上下颠倒的（需要设计的膜的一面朝向物镜一侧）。
问5：我怎么确定我设计的微图案处在电镜网格的网眼范围内？
答：Leonardo photopatterning software可以自动检测电镜网格的网眼。然后可以将微图案定位于其中，并调整图案尺寸使其完美契合。当然，Leonardo software也能进行预期结果的预览，因此您能在进行微图案化操作之前进行任何手动的修改。
问6：准备微图案化的电镜网格的过程需要多久？
答：每天您可生成5-15个微图案化的电镜网格，包括了从anti-fouling coating到protein incubation的所有步骤。
问7：操作电镜网格是一个精细的步骤，看上去这个过程增加了更多的操作步骤，有没有解决办法呢？
答：的确，微图案化的过程增加了更多的操作步骤，但是经过培训，您将学会如何进行微图案化操作而不会损坏电镜网格。进一步而言，我们能开发特定的PDMS stencils（PDMS模板），可以将网格放置在盖玻片（或其他物品）上，并在整个操作流程中保持其位置不动，以减少对网格的操作。
问8：用PRIMO系统在电镜网格上得到的微图案的分辨率是多少？
答：用PRIMO无掩膜微图案系统在电镜网格中得到的微图案的分辨率是1.2µm，与在玻璃上得到的分辨率一致。
问9：能否在种植细胞之前保存已经进行微图案化的网格，能保存多久？
答：可以，在吸附蛋白之前，准备好的电镜网格可以在PBS溶液中保存一个月。
问10：PEG覆盖层的厚度是多少？
答：PEG覆盖层的厚度大概是5nm。
问11：在电镜网格微图案化之后，什么样的细胞可以种植上去？
答：与在玻璃上进行微图案化操作一样，经典的哺乳动物贴壁细胞可以种植在TEM网格的微图案上。目前为止，我们团队和用户已经成功操作的细胞包括：HeLa细胞、成纤维细胞（fibroblasts）、内皮细胞（epithelial cells）、MDCKⅡ、PtK1。
问12：微图案化对细胞的状态和功能的影响如何？
答：通过控制细胞粘附，微图案化对它们的功能和行为有一定的影响。因为能建立更受控的、重现性更强的体外生化微环境，微图案法能在更加生理相关的条件下研究活细胞（Thery, Journal of Cell Science,2010）
问13：有没有利用你们的技术进行Cryo-ET研究的论文可供参考？
答：有的，您可以参考以下论文：
【1】M. Toro-Nahuelpan et.al., Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies, Nature Methods, 17, pp.50–54 (2020), https://doi.org/10.1038/s41592-019-0630-5 (Julia Mahamid's lab, EMBL)
【2】L. Engel et.al., Extracellular matrix micropatterning technology for whole cell cryogenic electron microscopy studies, Journal of Micromechanics and Microengineering, Volume 29, Number 11 (2019), https://doi.org/10.1088/1361-6439/ab419a (Beth Pruitt's lab, Stanford University, UC Santa Barbara)
【3】L. Engel et.al., Lattice micropatterning of electron microscopy grids for improved cellular cryo-electron tomography throughput, BioRxiv, posted Aug 31,2020, doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.30.272237 (Alexander Dunn's lab, Stanford University)